人體MDM2蛋白的重組表達,純化及鑒定研究.pdf

1、MDM2(Murine double minute2)是RING(Really interesting new gene)型泛素蛋白連接酶的重要成員之一。它最主要的生理功能是負(fù)調(diào)控抑癌蛋白p53，通過與p53的直接結(jié)合抑制p53轉(zhuǎn)錄因子活性，促進p53泛素化修飾、降解及其出核移位過程。MDM2是p53最重要的抑制因子，通過多種分子機制調(diào)控p53的穩(wěn)定性及生物功能，其過程及具體機制繁多且復(fù)雜。MDM2蛋白主要由N端到C端有四個功能區(qū)構(gòu)成，

2、其中氨基端的19-110氨基酸的Ⅰ區(qū)可以使MDM2與p53基因緊密結(jié)合；200-280高度酸性區(qū)域的Ⅱ區(qū)可以與核糖體15蛋白及5srRNA相互結(jié)合；300-330氨基酸區(qū)域的Ⅲ區(qū)則含有一個鋅指結(jié)構(gòu)；438-491氨基酸的IV區(qū)包含一個環(huán)指結(jié)構(gòu)，參與各種蛋白質(zhì)之間的作用。
　　MDM2既能通過與p53直接結(jié)合來抑制p53轉(zhuǎn)錄因子活性，同時也能利用其非p53依賴途徑而發(fā)揮致癌作用。有研究顯示，在p53缺失的條件下，mdm2的轉(zhuǎn)基因小鼠

3、也容易自發(fā)性形成腫瘤。在至少百分之七的腫瘤中，p53基因是正常的而mdm2基因卻異常擴增。同時，在腫瘤及正常組織中，至少已鑒定出40多種不同的mdm2剪接體，而其中大多數(shù)剪接體都不含有p53結(jié)合區(qū)，表明MDM2癌基因活性的發(fā)揮另外存在某種不依賴于p53的其他途徑。MDM2通過對一系列底物分子蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控作用，參與調(diào)節(jié)基因組的穩(wěn)定性、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過程。MDM2作為聯(lián)系腫瘤發(fā)生與泛素蛋白酶體系統(tǒng)的重要蛋

4、白，無疑是未來相關(guān)藥物研發(fā)的富有前景的靶標(biāo)之一。
　　本論文利用大腸桿菌SUMO表達系統(tǒng)制備了人體MDM2蛋白，并對該蛋白進行了純化和鑒定研究。我們發(fā)現(xiàn)一步純化可使MDM2蛋白達到90％的純度；我們在對MDM2鑒定的過程中發(fā)現(xiàn)，MDM2蛋白aa368-aa429的氨基酸序列中，其中六個磷酸化位點的突變對MDM2蛋白泛素化功能的發(fā)揮起到了重要的作用，但該突變對MDM2蛋白的表達卻影響不大。MDM2蛋白C端結(jié)構(gòu)域在其結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)揮著

5、重要的作用。為了更好地研究MDM2蛋白及其結(jié)構(gòu)域特性，我們創(chuàng)新性地將MDM2蛋白C端300-491位氨基酸（CTD，C Terminal Domain，包括Zinc Finger結(jié)構(gòu)域和RING結(jié)構(gòu)域）進行單獨地重組構(gòu)建，純化和鑒定。利用大腸桿菌SUMO表達系統(tǒng)獲得了大量的融合蛋白，并通過Ni-NTA親和純化和ULP1酶切獲得純化率為90%的CTD蛋白。目的蛋白接下來可通過硫酸銨沉淀大幅度提高純化程度并保持穩(wěn)定。離子交換顯示CTD蛋白仍

6、保留結(jié)合DNA的能力，因此，在細(xì)胞懸液中加入DNASE可有效去除DNA并提高親和純化步驟的蛋白產(chǎn)率。我們最后利用Superdex75型號的分子篩對目的蛋白進行鑒定，其蛋白洗脫峰位置對應(yīng)的蛋白分子量大小在35-43 kDa之間，與其在SDS-PAGE上鑒定的分子量大小一致，說明我們表達的CTD蛋白是單體結(jié)構(gòu)。最終CTD蛋白純化率為95%，產(chǎn)量為2 mg/L。
　　本論文創(chuàng)新重組表達了MDM2蛋白及其重要的CTD結(jié)構(gòu)域，并找到了簡捷高