人體MDM2蛋白的重組表達(dá),純化及鑒定研究.pdf

1、MDM2(Murine double minute2)是RING(Really interesting new gene)型泛素蛋白連接酶的重要成員之一。它最主要的生理功能是負(fù)調(diào)控抑癌蛋白p53，通過(guò)與p53的直接結(jié)合抑制p53轉(zhuǎn)錄因子活性，促進(jìn)p53泛素化修飾、降解及其出核移位過(guò)程。MDM2是p53最重要的抑制因子，通過(guò)多種分子機(jī)制調(diào)控p53的穩(wěn)定性及生物功能，其過(guò)程及具體機(jī)制繁多且復(fù)雜。MDM2蛋白主要由N端到C端有四個(gè)功能區(qū)構(gòu)成，

2、其中氨基端的19-110氨基酸的Ⅰ區(qū)可以使MDM2與p53基因緊密結(jié)合；200-280高度酸性區(qū)域的Ⅱ區(qū)可以與核糖體15蛋白及5srRNA相互結(jié)合；300-330氨基酸區(qū)域的Ⅲ區(qū)則含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)；438-491氨基酸的IV區(qū)包含一個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)，參與各種蛋白質(zhì)之間的作用。
　　MDM2既能通過(guò)與p53直接結(jié)合來(lái)抑制p53轉(zhuǎn)錄因子活性，同時(shí)也能利用其非p53依賴途徑而發(fā)揮致癌作用。有研究顯示，在p53缺失的條件下，mdm2的轉(zhuǎn)基因小鼠

3、也容易自發(fā)性形成腫瘤。在至少百分之七的腫瘤中，p53基因是正常的而mdm2基因卻異常擴(kuò)增。同時(shí)，在腫瘤及正常組織中，至少已鑒定出40多種不同的mdm2剪接體，而其中大多數(shù)剪接體都不含有p53結(jié)合區(qū)，表明MDM2癌基因活性的發(fā)揮另外存在某種不依賴于p53的其他途徑。MDM2通過(guò)對(duì)一系列底物分子蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控作用，參與調(diào)節(jié)基因組的穩(wěn)定性、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化及DNA損傷修復(fù)等多種生物學(xué)過(guò)程。MDM2作為聯(lián)系腫瘤發(fā)生與泛素蛋白酶體系統(tǒng)的重要蛋

4、白，無(wú)疑是未來(lái)相關(guān)藥物研發(fā)的富有前景的靶標(biāo)之一。
　　本論文利用大腸桿菌SUMO表達(dá)系統(tǒng)制備了人體MDM2蛋白，并對(duì)該蛋白進(jìn)行了純化和鑒定研究。我們發(fā)現(xiàn)一步純化可使MDM2蛋白達(dá)到90％的純度；我們?cè)趯?duì)MDM2鑒定的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，MDM2蛋白aa368-aa429的氨基酸序列中，其中六個(gè)磷酸化位點(diǎn)的突變對(duì)MDM2蛋白泛素化功能的發(fā)揮起到了重要的作用，但該突變對(duì)MDM2蛋白的表達(dá)卻影響不大。MDM2蛋白C端結(jié)構(gòu)域在其結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)揮著

5、重要的作用。為了更好地研究MDM2蛋白及其結(jié)構(gòu)域特性，我們創(chuàng)新性地將MDM2蛋白C端300-491位氨基酸（CTD，C Terminal Domain，包括Zinc Finger結(jié)構(gòu)域和RING結(jié)構(gòu)域）進(jìn)行單獨(dú)地重組構(gòu)建，純化和鑒定。利用大腸桿菌SUMO表達(dá)系統(tǒng)獲得了大量的融合蛋白，并通過(guò)Ni-NTA親和純化和ULP1酶切獲得純化率為90%的CTD蛋白。目的蛋白接下來(lái)可通過(guò)硫酸銨沉淀大幅度提高純化程度并保持穩(wěn)定。離子交換顯示CTD蛋白仍

6、保留結(jié)合DNA的能力，因此，在細(xì)胞懸液中加入DNASE可有效去除DNA并提高親和純化步驟的蛋白產(chǎn)率。我們最后利用Superdex75型號(hào)的分子篩對(duì)目的蛋白進(jìn)行鑒定，其蛋白洗脫峰位置對(duì)應(yīng)的蛋白分子量大小在35-43 kDa之間，與其在SDS-PAGE上鑒定的分子量大小一致，說(shuō)明我們表達(dá)的CTD蛋白是單體結(jié)構(gòu)。最終CTD蛋白純化率為95%，產(chǎn)量為2 mg/L。
　　本論文創(chuàng)新重組表達(dá)了MDM2蛋白及其重要的CTD結(jié)構(gòu)域，并找到了簡(jiǎn)捷高