Append融合蛋白的表達、純化及活性鑒定.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計，腫瘤的發(fā)病率和死亡率繼心血管疾病、感染性疾病之后位居第三，是危害人類健康最嚴重的疾病之一。目前，腫瘤的臨床治療包括：手術(shù)治療、放療和化療。手術(shù)雖然能夠切除腫瘤組織，但治療效果并不樂觀。使用放、化療殺傷腫瘤細胞時，正常組織和細胞也同樣受到損傷，導致出現(xiàn)并發(fā)癥。 所以，尋找特異性的腫瘤細胞殺傷藥物成為了腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點。 研究表明細胞的無限制增殖和腫瘤新生血管的形成是腫瘤生長過程中的兩個關(guān)鍵因

2、素，如果抗腫瘤藥物能夠同時瞄準以上兩個目標，既能抑制腫瘤細胞增殖又能抑制血管新生，采取“多個靶點”方式攻擊，就能獲得更好的臨床效果。 凋亡素(Apoptin)是一種來源于雞貧血病病毒(chicken anemia virus，CAV)的小蛋白質(zhì)(VP3)，由121個氨基酸組成，分子量為13.6kDa，它能夠誘導腫瘤細胞凋亡，但對正常細胞不造成損傷。一系列的研究結(jié)果表明Apoptin有望成為腫瘤特異性治療和診斷試劑。 人內(nèi)

3、皮抑素(Endostatin)為膠原蛋白ⅩⅧ的C末端片段，編碼184個氨基酸，分子量為18.5kDa，是近年來發(fā)現(xiàn)的最有效的血管生成抑制因子之一。作為一種特異性血管內(nèi)皮細胞生長抑制因子，內(nèi)皮抑素可以明顯抑制新生血管的生成、腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。 基于上述考慮，本實驗室構(gòu)建一種新的融合基因，命名為Append，其表達產(chǎn)物為以柔性多肽--甘氨酸接頭(Gly4Ser)3將Apoptin與Endostatin連接起來的融合蛋白。希望該融合蛋

4、白兼具Apoptin與Endostatin的生物功能，為腫瘤治療提供一種新策略。 本研究通過PCR從pLLP-OmpA-Append質(zhì)粒中擴增Append基因片段，將純化的片段克隆至pGEM-T Easy載體中，經(jīng)酶切PCR及序列測定驗證，結(jié)果表明獲得了全長為960bp的Append基因片段；將測序正確的Append基因片段亞克隆進pET-His表達載體中，經(jīng)酶切和PCR鑒定正確的載體命名為pET-His-Append。

5、 將上述陽性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入Ecoli BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細胞中，挑取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化出的單菌落進行培養(yǎng)，待OD600約為0.5加IPTG誘導表達，1.5h后收集菌體進行SDS-PAGE電泳分析及Western blotting驗證，結(jié)果表明獲得的目的蛋白大小與預(yù)期相符，約為35kDa；經(jīng)表達條件的優(yōu)化，確定了pET-His-Append最適表達條件為37℃誘導2.5h，誘導劑IPTG的濃度為80μg/mL，其中目的蛋白(包涵

6、體)占菌體蛋白的34.9％。采用鎳瓊脂糖親和層析法對表達的包涵體進行純化，通過改變洗脫液(咪唑)濃度來獲得目的蛋白，最終獲得Append融合蛋白濃度為1.43mg/L，純度為93.6％。 純化后的融合蛋白通過MTT及CAM實驗分析其對新生血管的作用，通過形態(tài)學觀察、DNA片斷化檢測及流式細胞儀分析其對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的作用，結(jié)果表明Append融合蛋白在體內(nèi)可以抑制血管的新生，在體外可以抑制臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖并可誘導人神經(jīng)膠質(zhì)