重組組織型纖溶酶原激活劑-RGDS肽融合蛋白的表達、純化及鑒定.pdf

1、目的：人組織纖溶酶原激活劑（tPA）屬于絲氨酸蛋白酶家族。它能將纖溶酶原轉換成纖溶酶，在臨床用于血栓性疾病的治療。通過原核表達和純化重組組織型纖溶酶原激活劑(tPA)-RGDS肽融合蛋白，并初步鑒定其生物學活性，為靶向性研究奠定基礎。
　　方法：1)設計引物利用聚合酶鏈式反應(PCR)方法使基因重組獲得目的基因片段tPA-RGDS，插入帶有His標簽的高效可溶性表達載體pQE30中，構建重組表達質粒pQE30-tPA-RGDS；將

2、重組表達質粒轉化至大腸桿菌（Escherichia coli, E.coli）BL21，經自誘導方法誘導目的基因表達；對融合蛋白His-tPA-RGDS用Ni-NTA親和層析柱純化；最后用纖維蛋白平板法評價其生物活性。
　　2)利用 PCR方法使基因重組獲得目的基因片段3C-tPA-RGDS，優(yōu)化原核表達條件（表達載體、表達菌、誘導溫度)，插入帶有His標簽的原核高效可溶性表達載體 pW28中，構建重組表達質粒pW28-3C-tP

3、A-RGDS，將重組表達質粒轉化至大腸桿菌Origami2，經自誘導方法誘導目的基因表達;對融合蛋白 His-3C-tPA-RGDS用Ni-NTA親和層析柱和DEAE陰離子交換層析柱純化，再用PreScission蛋白酶切3C蛋白從而切除His標簽，用分子篩純化和分析融合蛋白tPA-RGDS聚集狀態(tài)，以SDS-PAGE分析其表達量和純度,用Western blot鑒定tPA-RGDS，最后用纖維蛋白平板法評價其生物活性。
　　結果

4、：構建重組表達質粒pQE30-tPA-RGDS和pW28-3C-tPA-RGDS經PCR、雙酶切鑒定及基因測序證實構建成功；His-tPA-RGDS和His-3C-tPA-RGDS融合蛋白在大腸桿菌中獲得可溶性上清表達；His-3C-tPA-RGDS融合蛋白在原核表達體系（pW28載體、Origami2菌株及37℃誘導溫度）得到了最優(yōu)的表達；通過 PreScission蛋白酶成功去除His標簽，得到 tPA-RGDS融合蛋白，SDS-P