重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)轉基因兔純合子的篩選及表達特性.pdf

1、血栓性疾病是一類嚴重危害人類健康和生命的疾病，可累及全身各個器官及系統(tǒng)，目前利用溶栓藥物成為治療此類疾病的主要方法。溶栓藥物經過不斷研究已發(fā)展到第三代，其中以重組人纖溶酶原激活劑(r-tPA)作為治療人類血栓性疾病的新型藥物。重組人組織纖溶酶原激活劑與天然t-PA具有相似的生物學活性，更具有溶栓能力強、與纖維蛋白親和力高、全身出血副作用小、半衰期長、總使用劑量少等特點。作為第三代溶栓藥物的新型代表，重組人纖溶酶原激活劑越來越受到血栓病患

2、者的青睞，具有廣闊的應用前景。
　　外源基因在轉基因純合子動物的整合拷貝數(shù)是轉基因半合子動物的兩倍。本研究旨在篩選出轉rhPA基因純合子兔，比較外源基因rhPA在轉基因純合子兔和轉基因半合子兔乳腺中的表達水平，探索在整合位點相同時，rhPA在轉基因兔乳腺中的表達量與其拷貝數(shù)之間的關系。篩選高水平表達的轉基因純合子兔，培育用于生物制藥的rhPA的轉基因純合子兔品系，為以后大規(guī)模制備溶血栓生物藥品建立基礎，并且用于藥理學和生物學活性分

3、析，有利于后期藥品開發(fā)應用。
　　本研究應用已經構建的乳腺特異表達載體PCL25/rhPA，通過原核期受精卵顯微注射制備轉rhPA基因家兔。經過PCR整合檢測和ELISA表達檢測篩選出原代轉基因表達兔。F1代轉基因表達兔兄妹同胞交配或回交獲得F2代轉基因兔，通過對F2代轉基因兔測交篩選出其中的轉基因純合子兔。ELISA檢測比較轉基因純合子兔與半合子兔乳清中rhPA的表達水平。
　　實驗以成年新西蘭母兔為實驗動物，將rhPA基

4、因片段通過顯微注射導入受精卵，移植受體64只，其中46只懷孕，出生仔兔207只，PCR整合陽性兔56只，存活37只。妊娠率為71.9％，陽性整合率為27.1％。
　　ELISA檢測37只轉基因兔（或后代）乳汁，其中12只兔乳腺特異性表達rhPA。
　　獲得的rhPA基因表達公兔K29與正常新西蘭母兔交配，共獲得了F1代仔兔25只，經PCR檢測篩選出F1代轉基因兔16只，其中母兔10只，公兔6只。從F1代轉基因兔中挑選公兔和母

5、兔同胞交配，共獲得F2代仔兔10只，經PCR檢測篩選出F2代轉基因兔5只，其中母兔4只，公兔1只。將F2代轉基因兔再與正常兔測交配種，通過對后代的PCR檢測，篩選出F2代中轉基因純合子兔。我們從F2代轉基因兔中篩選出2只雌性轉rhPA基因純合子兔（編號K29 F2-05和K29 F2-09）。通過對K29 F2-09奶樣的ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)其乳汁中重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)的表達水平明顯高于半合子轉基因兔。
　　本研究獲得

6、了乳腺特異性表達轉基因兔，建立了PCL25/rhPA轉基因兔基本繁殖群（K29系），并培育篩選出2只轉rhPA基因純合子母兔（編號K29 F2-05和K29 F2-09），經ELISA檢測結果顯示K29 F2-09母兔奶樣中的rhPA表達量明顯高于轉rhPA基因半合子兔。實驗研究結果證明PCL25/rhPA在轉基因純合子兔乳腺中的表達量高于轉基因半合子兔的表達量。
　　本研究驗證了以培育轉基因純合子動物來提高外源基因表達量的可行性