轉(zhuǎn)基因兔乳腺特異性表達(dá)重組人纖溶酶原激活劑(rhPA)及其藥效學(xué)研究.pdf

1、自上世紀(jì)以來，血栓性疾病一直是危害人類健康和生命安全的頭號(hào)因素，溶栓療法是目前臨床上使用最廣泛而有效的一種治療方法，而且溶栓藥物已經(jīng)歷了三代發(fā)展。人組織纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogen activator, t-PA)是由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成并分泌的一種絲氨酸蛋白酶，能夠高效特異地溶解血栓，是一種良好的第二代溶栓藥物。重組人纖溶酶原激活劑(recombinant human plasminogen activa

2、tor,rhPA)是天然t-PA的重組突變體，屬于新型第三代溶栓藥物，具有較天然t-PA更加優(yōu)越的溶栓功能。利用動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)t-PA及其重組突變體，具有產(chǎn)量高、成本低、翻譯后修飾、生物活性高等優(yōu)于其它表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)。應(yīng)用多種純化技術(shù)相結(jié)合的策略，能夠方便、快捷、高效地將目標(biāo)蛋白從動(dòng)物乳汁中分離純化出來。現(xiàn)今，國內(nèi)外已有很多關(guān)于以上研究內(nèi)容的報(bào)道。
　　本研究目的旨在:將構(gòu)建正確而有效的rhPA乳腺特異性表達(dá)載體（F、E

3、、K1區(qū)缺失重組體t-PA）應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因兔中，研究其表達(dá)水平和活性功能，以期獲得高效表達(dá)rhPA的轉(zhuǎn)基因兔;研究各種分離純化表達(dá)兔乳中rhPA的方法和策略，以期獲得高純度、高回收率、高活性的rhPA;研究小鼠血栓和溶栓模型，以期獲得最佳的動(dòng)物溶栓效果;同時(shí)，還研究了rhPA單克隆抗體的制備和篩選方法，以期獲得能夠用作親和層析配體的多羥基反應(yīng)單克隆抗體(PR-mAb)。從而，最終獲得一種新穎、高效的溶栓藥物。相關(guān)研究方法和結(jié)果如下:

4、>　　1.采用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，分別以山羊β-酪蛋白基因(β-casein)、山羊β-乳球蛋白基因(BLG)和牛αsl酪蛋白基因(αs1-casein)作為調(diào)控元件，以天然t-PA的F、E、K1區(qū)缺失體作為編碼蛋白序列，構(gòu)建了乳腺特異性表達(dá)載體PCL25/rhPA、BLC14/rhPA和AP/rhPA。經(jīng)酶切圖譜和測序比對(duì)結(jié)果顯示，構(gòu)建的載體與理論序列完全一致。
　　2.通過膠原酶消化組織法建立山羊乳腺上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)體系，電轉(zhuǎn)

5、染三種載體，經(jīng)600μg/mL G418篩選兩周后，挑取生長旺盛、狀態(tài)較好的單克隆細(xì)胞集落，傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。經(jīng)PCR檢測，PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA三種載體分別獲得了79株、66株、63株整合陽性單克隆細(xì)胞株，并應(yīng)用5μM催乳素進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。ELISA檢測72h后細(xì)胞誘導(dǎo)上清液，25株轉(zhuǎn)PCL25/rhPA基因細(xì)胞株高水平表達(dá)rhPA，3株轉(zhuǎn)BLC14/rhPA基因細(xì)胞株表達(dá)rhPA，而轉(zhuǎn)AP/rhPA基因

6、細(xì)胞株未見表達(dá)。經(jīng)纖維蛋白平板溶圈法(FAPA)檢測，所有誘導(dǎo)表達(dá)上清液均具有體外溶栓活性功能。結(jié)果表明，在細(xì)胞水平，PCL25/rhPA和BLC14/rhPA載體能夠有效地驅(qū)動(dòng)rhPA基因特異性表達(dá)，且PCL25/rhPA載體的表達(dá)水平明顯高于其它兩種載體。從而，驗(yàn)證了構(gòu)建的PCL25/rhPA載體是合理而有效的。
　　3.將以上三個(gè)構(gòu)建(PCL25/rhPA、BLC14/rhPA、AP/rhPA)經(jīng)顯微注射導(dǎo)入到兔受精卵中，共

7、移植94只受體，妊娠71只，出生319只仔兔，PCR檢測85只為轉(zhuǎn)基因整合陽性兔，妊娠率為75.5％(71/94)，整合率為26.6％(85/319)。ELISA檢測57只存活轉(zhuǎn)基因兔（或后代）乳汁，共12只乳腺特異性表達(dá)rhPA（PCL25/rhPA11只，BLC14/rhPA1只），表達(dá)水平約在5.2-630μg/mL之間。SDS-PAGE電泳和Westem Blot檢測該12只兔乳，均出現(xiàn)約39KDa大小的目標(biāo)特異性條帶。FAPA

8、結(jié)合ELISA測定表達(dá)產(chǎn)物的體外溶栓比活性，最高可達(dá)360倍左右（A29，與阿替普酶相比）。測交檢測高表達(dá)水平的A29系轉(zhuǎn)基因兔，1只F2代(A29F2-09)的所有后代仔兔均為整合陽性(100％，13/13); Real-time PCR檢測相對(duì)拷貝數(shù)，該只兔約是其它同系轉(zhuǎn)基因兔的2倍。從而，證明了A29F2-09為純合子轉(zhuǎn)基因兔，且rhPA表達(dá)水平約1000μg/mL，明顯高于非純合子兔;不同系轉(zhuǎn)基因兔拷貝數(shù)與表達(dá)水平間沒有相關(guān)性。

9、以上結(jié)果表明，PCL25/rhPA載體能夠在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中高效表達(dá)活性rhPA;表達(dá)水平主要與整合位點(diǎn)有關(guān);當(dāng)整合位點(diǎn)一致時(shí)，表達(dá)水平隨拷貝數(shù)的增加也相應(yīng)地累積提高。
　　4.通過傳統(tǒng)弗氏佐劑和快速免疫佐劑兩種方法免疫小鼠，結(jié)果顯示在免疫小鼠血清效價(jià)、免疫原劑量和免疫周期上，快速免疫佐劑都大大地優(yōu)越于弗氏佐劑(1010/109，20μg/1300μg，35d/70d)。通過電脈沖和化學(xué)PEG兩種方法將免疫后的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與SP

10、2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，結(jié)果顯示電融合效率明顯高于化學(xué)PEG融合(166％/88.4％)。通過HAT和HT篩選及有限稀釋法亞克隆后，共獲得12株能夠穩(wěn)定分泌高效價(jià)抗體的雜交瘤細(xì)胞株（標(biāo)號(hào)C1-C12）。ELISA-elution檢測，有3株為多羥基反應(yīng)單克隆抗體(PR-mAb，標(biāo)號(hào)C1、C4、C8)，占單克隆抗體總數(shù)的25％(3/12)。小鼠腹腔誘導(dǎo)法大量制備抗體，C1、C4、C8株腹水效價(jià)分別是108、1010、108，且無交叉非特

11、異性反應(yīng)，能夠?yàn)橛H和層析所用。
　　5.通過離心脫脂、35％飽和硫酸銨沉淀、超濾及透析等方法進(jìn)行兔乳前處理，獲得粗純樣品。將C4株抗體與CNBr activated Bestarose4FF偶聯(lián)來制備免疫親和層析柱，偶聯(lián)率高達(dá)96.5％。嘗試五種不同的洗脫液(A:0.1mol/L甘氨酸，pH2.5;B:0.1mol/L甘氨酸，pH3.5;C:0.1mol/L甘氨酸，pH5.0; D:0.75mol/L硫酸銨+40％丙二醇的TE緩沖

12、液，pH7.9;E:0.2MNaH2P04-檸檬酸，pH2.2），來探索最佳洗脫效果的條件，結(jié)果顯示0.75mol/L硫酸銨+40％丙二醇的TE緩沖液(pH7.9)洗脫效果最佳，但pH較低的強(qiáng)酸緩沖液(A、B、E)也能夠達(dá)到洗脫要求，而pH較高的C洗脫液則出現(xiàn)雜蛋白較多且回收率低。再嘗試Chromdex75prep grade凝膠過濾預(yù)裝柱來進(jìn)一步分離純化目標(biāo)蛋白rhPA，上樣體積為1％和2.5％能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白完全分開，出現(xiàn)兩個(gè)獨(dú)立的峰

13、;而上樣體積為5％則不能夠?qū)⒛繕?biāo)蛋白完全分開，出現(xiàn)兩個(gè)相互交叉重疊峰。經(jīng)免疫檢測及飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定該純化產(chǎn)物為目標(biāo)rhPA。與BSA對(duì)照品相比，雙向電泳結(jié)果顯示，純化產(chǎn)物的大小約39KDa（在35-40KDa之間），等電點(diǎn)約7.1（BSA等電點(diǎn)約4.7），純度可達(dá)96％-99％或更高（BSA純度96％-99％）。與阿替普酶對(duì)照品相比，圓二色譜分析顯示，該純化產(chǎn)物與阿替普酶有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu);FAPA測定純化產(chǎn)物rhPA的體外溶栓比活性，其

14、值高達(dá)約214倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于阿替普酶溶栓藥。
　　6.以HitrapTM CaptoTM Q-1 mL離子交換柱去內(nèi)毒素，經(jīng)試劑盒測試，內(nèi)毒素含量低于0.015EU/mL。分別以0.3mL/只小鼠腹腔注射1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％濃度的角叉菜膠，來探索誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成的最佳條件，結(jié)果顯示以0.05％濃度的角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠尾部血栓形成條件最佳。以不同的“給藥”濃度（低劑量組0.1mg/只、中劑量組0.4mg/

15、只、高劑量組1.6mg/只及阿替普酶、生理鹽水對(duì)照組）對(duì)小鼠血栓模型病進(jìn)行治療，結(jié)果顯示純化產(chǎn)物rhPA作為溶栓藥物治療小鼠尾部血栓，在效果和劑量上明顯優(yōu)越于阿替普酶，且rhPA高劑量組（1.6mg/只）在三次給藥后(32h)能夠完全治愈小鼠尾部血栓疾病。
　　以上結(jié)果表明，我們構(gòu)建的F、E、K1區(qū)缺失重組體t-PA（PCL25/rhPA載體）是合理、有效的，且能夠在轉(zhuǎn)基因兔乳腺中高效表達(dá);表達(dá)產(chǎn)物rhPA能夠相對(duì)單獨(dú)地存在于兔乳