脂肪細(xì)胞分化過程中纖溶酶原激活劑抑制物-1基因的表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、纖溶酶原激活劑抑制物-1(PlasminogenActivatorInhibitor-1，PAI-1)屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，其結(jié)構(gòu)與其它絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員相似，有含精氨酸的活性中心和與蛋白水解酶結(jié)合的偽作用底物。在生理情況下，PAI-1與組織型和尿激酶型纖溶酶原激活劑結(jié)合，從而抑制了纖溶酶原向纖溶酶的轉(zhuǎn)化。它是纖溶系統(tǒng)的主要抑制因子，在溶解纖維蛋白和組織蛋白水解過程中發(fā)揮著重要的作用。PAI-1與蛋白水解相關(guān)的功能主要

2、有血管生成、抑制血漿纖溶依賴的金屬蛋白酶活性等。 肥胖是心血管疾病發(fā)生的重要危險(xiǎn)因子，與動(dòng)脈粥樣硬化、中風(fēng)和充血性心肌梗死密切相關(guān)。患者血漿PAI-1濃度的增高是一個(gè)重要的生物標(biāo)簽，可以解釋肥胖及代謝綜合癥病人增加血管栓塞風(fēng)險(xiǎn)的原因。最近的研究表明，PAI-1直接影響肥胖的并發(fā)癥，包括心臟動(dòng)脈栓塞和2型糖尿病，甚至還影響內(nèi)臟脂肪的堆積。血漿PAI-1濃度的升高是心血管疾病發(fā)生的主要指標(biāo)和再發(fā)性心肌梗塞和深靜脈血栓的前兆。3T3

3、-L1細(xì)胞株是最常用的體外模擬脂肪細(xì)胞分化的模型，生長至接觸抑制的前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)后重新進(jìn)入細(xì)胞周期，經(jīng)歷兩輪左右的有絲分裂后，細(xì)胞進(jìn)入分化的終末階段。 本研究中3T3-L1前脂肪細(xì)胞按標(biāo)準(zhǔn)的誘導(dǎo)方案完全地分化為成熟的脂肪細(xì)胞，細(xì)胞的數(shù)目增多和細(xì)胞的體積隨著細(xì)胞內(nèi)的脂滴增多而變大。脂肪細(xì)胞分化的特異標(biāo)志分子如過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorγ，PPAR

4、γ)和422/aP2隨著細(xì)胞的分化而表達(dá)。在脂肪細(xì)胞分化過程中，PAI-1的表達(dá)隨著脂肪細(xì)胞的分化而增加(包括蛋白質(zhì)水平和mRNA水平)，與PPARγ的表達(dá)及其調(diào)控的目標(biāo)基因422/aP2密切相關(guān)。 通過對(duì)PAI-1啟動(dòng)子的連續(xù)缺失體轉(zhuǎn)染分化第2天的脂肪細(xì)胞后報(bào)告基因活性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAI-1啟動(dòng)子的報(bào)告基因活性在加入PPARγ的特異性配體吡格列酮(Pioglitazone)后上調(diào)，提示PPARγ在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)PAI-1的表

5、達(dá)。當(dāng)啟動(dòng)子缺失了-235bp至-178bp區(qū)間時(shí)，PPARγ對(duì)PAI-1啟動(dòng)子活性的誘導(dǎo)作用消失。 綜合生物信息學(xué)分析和參考以往的文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，PAI-1啟動(dòng)子可能存在一個(gè)不典型的過氧化物酶體增殖物激活受體反應(yīng)元件(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorResponsiveElement，PPRE)，即不典型的PPRE(PPRE-like)堿基序列(TCCCCCATGCCCT)。凝膠電泳

6、遷移分析(ElectrophoreticMobilityShiftAssay，EMSA)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此段序列可與脂肪細(xì)胞核抽提物結(jié)合，結(jié)合條帶的位置與經(jīng)典的PPRE(ConsensusPPRE)電泳遷移位置相近；未標(biāo)記的PAI-1不典型PPRE和經(jīng)典的PPRE冷探針可以完全競爭抑制這種結(jié)合反應(yīng)；而且經(jīng)吡格列酮處理后的脂肪細(xì)胞核抽提物的特異性結(jié)合反應(yīng)明顯增強(qiáng)；進(jìn)一步用抗體阻滯遷移(Supershift)實(shí)驗(yàn)證明了PPARγ與不典型PP

7、RE之間的相互作用關(guān)系。但是PAI-1啟動(dòng)子的不典型PPRE探針與前脂肪細(xì)胞核抽提物不發(fā)生結(jié)合。 在前脂肪細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染PPARγ和類視黃醇X受體a(RetinoidXReceptora，RXRa)時(shí)，野生型PAI-1的啟動(dòng)子活性明顯增高(TCCCCCATGCCCT)；加入PPARγ特異性配體吡格列酮后，啟動(dòng)子報(bào)告基因活性進(jìn)一步上調(diào)；而突變型PAI-1啟動(dòng)子(TCTCGATTGCCAT)報(bào)告基因活性沒有明顯變化。 轉(zhuǎn)

8、染分化第2天的脂肪細(xì)胞(已有內(nèi)源性PPARγ的表達(dá))，野生型PAI-1啟動(dòng)子報(bào)告基因在加入吡格列酮后，活性明顯增加；突變了PAI-1不典型PPRE后，吡格列酮誘導(dǎo)啟動(dòng)子活性增加的作用也消失。 用PPARγ特異性配體吡格列酮處理分化第2天的脂肪細(xì)胞，Westernblotting分別檢測細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAI-1的表達(dá)和分泌明顯增多。 因此，在脂肪細(xì)胞分化過程中，不典型PPRE(-206bpTCCCCCATG

9、CCCT-194bp)在PAI-1基因的表達(dá)調(diào)控方面起著重要作用。人PAI-1基因啟動(dòng)子也存在與不典型PPRE相似的堿基序列(-987bpTCCCCTCACCCCCT-974bp)，提示在肥胖形成過程中，脂肪細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子PPARγ通過作用PAI-1基因啟動(dòng)子的不典型PPRE而上調(diào)PAI-1表達(dá)。 臨床上使用噻唑烷二酮(Thiazolidinediones，TZDs)類藥物治療2型糖尿病發(fā)現(xiàn)，患者血漿中PAI-1水平下