食血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑及其缺失突變體的構建、表達及活性研究.pdf

1、食血蝙蝠唾液纖溶酶原激活劑,是美國科學家Stephen J.Gardell于1989年從南美洲吸血蝙蝠Desmodus rotundus的唾液中分離獲得,是一種組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)類似物。該類似物共有四種形式,分別為:DSPAa1、DSPAa2、DSPAβ、DSPAγ。其中,DSPAa含有指形(Finger)區(qū)、表皮生長因子(E,與hEGF相似)區(qū)、kringle(K)區(qū)和絲氨酸蛋白酶(P)區(qū),DSPAβ含E、K、P區(qū),DS

2、PAγ只有K和P區(qū)。所有的DSPA都只有單鏈形式,具有酰胺水解活性,對纖溶酶原的激活嚴格要求血纖蛋白作為輔助因子,否則不能激活纖溶酶原。其中DSPAa1已在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、昆蟲細胞、轉基因煙草、巴斯德畢赤酵母中得到表達,DSPAa2已在大腸桿菌、巴斯德畢赤酵母中得到表達,DSPAγ已在中國倉鼠卵巢細胞(CHO)中得到表達。研究發(fā)現(xiàn),同t-PA相比,DSPAa1的血纖蛋白依賴性和選擇特異性更高,當血纖蛋白存在時,DSPAa1的

3、催化速率將提高105倍,而t-PA僅提高550倍。DSPAa2的纖溶活性較DSPAa1低。DSPAγ具有溶栓能力,但其作用大大低于DSPAa1,即Finger和EGF區(qū)的缺失大大降低DSPAa1的活性,即結構的改變顯著影響溶栓作用。為此,分別構建了缺失E區(qū)的DSPAa1突變體和缺失F區(qū)的DSPAβ以及缺失E區(qū)和F區(qū)的突變體DSPAγ,目的是進一步研究DSPA結構與功能的關系,確定DSPA纖溶活性的必需結構域,為新藥的研發(fā)提供一定的理論依

4、據(jù)。
　　 本課題首先運用小片段引物合成和片段拼接等技術,人工合成包括缺失E區(qū)的DSPAa1(簡稱mDSPAa1)、DSPAβ和DSPAγ并克隆到表達載體pPIC9K上；成功構建出mDSPAa1/pPIC9K、DSPAB/pPIC9K和DSPAγ/pPIC9K重組質粒。然后,將構建的重組質粒轉化到巴斯德畢赤酵母GS115中,mDSPAa1經過G418濃度梯度抗性篩選、小量表達后經SDS-PAGE電泳檢測獲得一高表達菌株,目的蛋白

5、的表達量占菌體總蛋白的30％以上,目的蛋白的分泌量大約為30mg/L。DSPAβ小量表達后經SDS-PAGE電泳檢測獲得一高表達菌株。對酵母工程菌mDSPAa1/GS115及DSPAβ/GS115進行大量表達,通過甲醇誘導分泌型表達重組蛋白mDSPAa1、DSPAβ,經過72 h誘導表達,離心,收集上清,65％硫酸銨沉淀,透析后,纖維平板法對其進行活性測定。以尿激酶為標準品,經測定DSPAa1活性為2.64x105U/mg,mDSPAa