人纖溶酶原K5突變體在原核系統(tǒng)的優(yōu)化表達、活性檢測與結(jié)構(gòu)改建.pdf

1、中山大學碩士學位論文人纖溶酶原K5突變體在原核系統(tǒng)的優(yōu)化表達、活性檢測與結(jié)構(gòu)改建Theoptimalexpression，activitydetectionandstructurerebuildingofKringle5ofhumanplasminogenmutantintheprokaryoticexpressionsystem專業(yè)：生物化學與分子生物學碩士研究生：溫南導師：高國全教授本課題獲國家自然科學基金教育部新世紀人才基金廣東省

2、科技計劃項目重大專項廣東省自然科學基金團隊項目廣州市科技攻關(guān)重點項目2007年5月廣州資助奎移絕k忍尊孑線，手铘，粉中文摘要究已對K5基因進行了改造，獲得比K5分子量更小、性質(zhì)更穩(wěn)定的K5突變體I(K5mutantl，K5mutl)基因工程純化蛋白。觀察其抑制肝癌血管生成和腫瘤生長的作用及其效果，從而進一步證明K5mutl具有更強的抑制肝癌血管生成和腫瘤生長的作用，為治療新生血管豐富的肝癌等惡性腫瘤提供新的并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程藥

3、物。為了優(yōu)化K5mutl在原核系統(tǒng)的表達，迸一步降低投入，增大產(chǎn)出，提高K5routl在原核系統(tǒng)pET22bBL21的單位表達量，本研究第一部分擬對原核系統(tǒng)中各種可能影響表達的因素如：抗生素濃度、PH、0D600值、IPTG終濃度、誘導溫度、誘導時間與細胞定位等進行研究，獲得優(yōu)化的表達條件，為工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白藥物奠定基礎，并對獲得的基因重組蛋白就其生物活性，進行細胞學上的檢測。既往獲得的融合蛋白K5mutl，在N端的融合部分

4、含有人工構(gòu)建的蛋白質(zhì)標簽Histag等部分，可能在后續(xù)體內(nèi)應用中導致機體產(chǎn)生免疫抗體，為了避免該情況的發(fā)生，本研究第二部分擬在原有重組體K5mutl的基礎上，對其進行改建，獲得新重組體K5mutlrEK，以使其重組蛋白表達后能在重組腸激酶的特異性切割作用下，去除原重組蛋白在N端的融合部分，獲得具有天然氨基酸序列的重組蛋白。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：第一部分K5突變體I的優(yōu)化表達和活性檢測1優(yōu)化K5mutl的各項表達條件。在原有實驗方案上，

5、通過分別調(diào)整下列可能影響表達的參數(shù)：抗生素濃度、PH、OD600值、IPTG終濃度、誘導時間、誘導溫度，同時固定其它參數(shù)。通過電泳分析，獲得K5mutl在原核系統(tǒng)pET22bBL21的最優(yōu)表達條件為：羧芐青霉素濃度為50lag／ml，PH為70的LB培養(yǎng)液中，37“C，搖床230rpm／min，搖菌至OD600值為0910，加入IPTG至終濃度為10retool／L，37℃誘導表達10h。2獲得高純度可溶性的突變體蛋白。采用優(yōu)化條件誘導