人纖溶酶原水解片段Kringle5突變體表達(dá)純化及抗血管增生功能研究.pdf

1、分類號(hào)VDC碩士學(xué)位論文密級(jí)人纖溶酶原水解片段kringle5突變體表達(dá)純化及抗血管增生功能研究”■■●l■●●●ExpressionandpurilicationaudantlanglogenlCfunctionresearchofthethehumanplasminogenkringle5mutant作者姓名：王小文學(xué)科專業(yè)：腫瘤學(xué)學(xué)院(系、所)：湘雅醫(yī)院指導(dǎo)老師：鐘美佐教授中南大學(xué)二O一二年十一月碩士學(xué)位論文中文摘要摘要目的：在細(xì)

2、胞水平探討GST標(biāo)簽的人纖溶酶原Kringle5基因工程蛋(了(GSTK5m)抗血管增生的作用。方法：利用primerpremier5。0引物設(shè)計(jì)軟件，PCR法得到K5m基因，再利用基因工程技術(shù)，將目的基因克隆至pGEX4T3的BamHI和XhoI位點(diǎn)。再將該pGEX4T3依5m重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到BL21(DE3)宿主菌中，表達(dá)出可溶性重組蛋白。采用GST樹脂親和純化融合蛋白，對(duì)純化的融合蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳和Westernblot分

3、析鑒定，結(jié)果顯示得到分子量約為37kDa的融合蛋白。為了驗(yàn)證GSTK5m融合蛋白是否具有生物學(xué)活性，用不同濃度的(251280nmol／L)GSTK5m融合蛋白分別處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HLWECs)、肝癌細(xì)胞(Bel7402)和正常肝細(xì)胞fr兒c)，MTT法檢測(cè)各組的細(xì)胞抑制率，PI單染法和hoechst33258染色法標(biāo)記各組凋亡細(xì)胞。用不同濃度的GSTK5m融合蛋白及His6K5重組蛋白處理HUVECs，接著用transwell實(shí)

4、驗(yàn)檢測(cè)GSTK5m融合蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移功能的影響。結(jié)果：GS■K5m融合蛋白可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(m艦Cs)的增殖，呈濃度依賴關(guān)系，但是對(duì)肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞存活率無明顯影響；GSTK5m融合蛋白對(duì)正常肝細(xì)胞(NLC)和肝癌細(xì)胞(Bel7402)無明顯凋亡誘導(dǎo)作用，但具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用；GSTK5m融合蛋白及His6K5重組蛋白均抑制HUVEC的遷移。結(jié)論：1、構(gòu)建了pGEX4T3／K5m重組質(zhì)粒，并獲得帶GST標(biāo)簽