尿激酶原突變體的分子設(shè)計、重組表達與性質(zhì)鑒定.pdf

1、在利用生物信息學的方法分析尿激酶原突變體GZ5-sPA-his結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，通過拼接PCR的方法構(gòu)建了缺失C端肽段SHFLPWIRSHTKEENGLAL編碼序列且突變了Lys<'156>→His、Gli<'157>→Ala．的新尿激酶原突變體基因gz5-spa-m2-his，并將其克隆入表達載體pET21b。該突變體在大腸桿菌菌株BL21(DE3)中獲得高效表達，并以包涵體形式存在，表達量約占總蛋白的30％。包涵體經(jīng)洗滌、變性

2、后，利用Ni<'2+> chelating sepharose金屬螯合層析分子篩進行柱上復(fù)性，成功獲得了可在低溫下穩(wěn)定保存的可溶性目標蛋白GZ5-sPA-M2-his，純度在90％以上。以S-2444為底物的酰胺解活性的實驗結(jié)果表明，缺失肽段SHFLPWIRSHTKEENGLAL后的GZ5-sPA-M2-his仍具有尿激酶原的生物活性。 同時，在GZ5-sPA-M2-his的基礎(chǔ)上，設(shè)計了N端缺失GPRPSGGAGSLKFQCG

3、QGGGGSRGDSGG．AGS肽段，C端缺失LTGIVSWGRGCALKDKPGVYTRVSHFLPWIRSHT KEENGLAL，同時點突變Cys<'73>→Ser、Cys<'220>→Ser的尿激酶原突變體scu-PAm，將其克隆入大腸桿菌菌株BL21(DE3)中獲得高效表達，30℃以下時同時以可溶表達與包涵體形式表達，超聲波破碎細胞后將可溶蛋白與尿激酶的發(fā)色底物S-2444進行酰胺解活性反應(yīng)，能夠引起S-2444的顏色反應(yīng)，表明

4、所獲可溶表達目的蛋白具有一定的生物活性。 另外，根據(jù)原核生物中多順反子的基因表達原理，以表達載體pET21b和 pMAL-C<,2>X為基礎(chǔ)，通過構(gòu)建共表達載體pET21b-gz5-spa-his-mbp，在大腸桿菌菌株 BL21(DE3)胞內(nèi)共表達尿激酶原突變體GZ5-sPA-his和融合伴體：MBP(maltose binding protein,麥芽糖結(jié)合蛋白)，期望利用后者可幫助蛋白折疊的功能，達到在大腸桿菌胞內(nèi)獲得可溶