人組織型纖溶酶原激活劑原核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大腸桿菌中的初步表達(dá).pdf

1、目的：通過構(gòu)建人組織型纖溶酶原激活劑(human tissue-typep Lasminogen activator tPA)原核表達(dá)載體，檢測tPA目的蛋白是否能在大腸桿菌中進(jìn)行初步表達(dá)，并進(jìn)一步探索最佳表達(dá)條件，希望經(jīng)純化、復(fù)性后獲得有活性的目的蛋白tPA，以滿足生產(chǎn)需要和臨床應(yīng)用。
　　方法：選用pET-28a為原核表達(dá)載體，從野生型tPA重組mRNA中克隆得到EST-tPA(含有人tPA基因全長的質(zhì)粒)，以此質(zhì)粒為模板，通

2、過設(shè)計(jì)上下游引物，于tPA的C末端加入RGDS四肽序列，利用PCR技術(shù)克隆擴(kuò)增目的基因片段RGDS-tPA，膠回收并純化。NcoI和XhoI分別雙酶切目的基因tPA及載體pET-28a。NcoI和XhoI黏性末端互補(bǔ)，體外連接酶切產(chǎn)物，重組體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞XL-1，篩選、酶切鑒定重組質(zhì)粒和測序鑒定。制備感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，將pET28a-tPA轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)。聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)顯示rtP

3、A在大腸桿菌中的表達(dá)。
　　結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳獲得目的基因片段rtPA的條帶約1700bp，鑒定為陽性重組體，測序證實(shí)為正確的pET28a-tPA序列；聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定獲得目的蛋白片段rtPA的條帶約53KDa，為非活性的包涵體。表達(dá)條件經(jīng)優(yōu)化后，rtPA在37℃下培養(yǎng)4小時表達(dá)量和表達(dá)水平較好；在25℃下培養(yǎng)8小時表達(dá)量和表達(dá)水平最佳；在17℃下培養(yǎng)12小時表達(dá)量和表達(dá)水平較前兩者下降。
　　結(jié)論：(1)人組織型纖