去除外源氨基酸的K5突變體設(shè)計(jì)與功能研究.pdf

1、血管增生(angiogenesis)是指在原有血管網(wǎng)基礎(chǔ)上形成新的毛細(xì)血管的過(guò)程。又被稱作為血管新生(neovascularization)。在創(chuàng)傷、月經(jīng)周期以及外周循環(huán)閉塞等情況下血管增生具有恢復(fù)血供和促進(jìn)傷口愈合的積極作用。但更多的情況下，血管增生參與疾病的發(fā)生與發(fā)展。病理性血管增生見(jiàn)于糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病腎病、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病。病理性血管增生也在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程中扮演了非常關(guān)鍵的角色，因

2、而阻斷或抑制血管增生是抗腫瘤治療的有效策略。近年來(lái)以血管增生為靶點(diǎn)治療腫瘤已成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，有多種血管增生抑制劑相繼進(jìn)進(jìn)臨床試驗(yàn)階段。
　　 人纖溶酶原裂解片段Kringle5(簡(jiǎn)稱K5)是新近發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性血管增生抑制因子，是抗血管增生活性最強(qiáng)的人纖溶酶原(plasminogen Plg)裂解片段，包含了Plg中Pro452-Ala542之間氨基酸序列，約有91多個(gè)氨基酸殘基，表觀分子量約為16kDa。k5空間結(jié)構(gòu)由

3、一個(gè)完整的Kringle結(jié)構(gòu)域和兩側(cè)氨基酸臂組成，其中80個(gè)序列嚴(yán)格保守氨基酸殘基組成了Kringle結(jié)構(gòu)域，且該結(jié)構(gòu)域由3個(gè)二硫鍵連接而成。
　　 我們?cè)缙谘芯恳沧C實(shí)了K5具有特異性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用；在視網(wǎng)膜血管增生和糖尿病大鼠模型中均發(fā)現(xiàn)K5能降低血管滲漏；在視網(wǎng)膜血管增生大鼠模型中我們進(jìn)一步觀察到K5及其突變體能預(yù)防和阻斷新生血管的形成；同時(shí)應(yīng)用相同來(lái)源的K5滴眼液證實(shí)K5亦可抑制兔角膜的血管增

4、生。最近本實(shí)驗(yàn)室在HepA肝癌皮下種植瘤模型上觀察到K5能顯著降低腫瘤組織中微血管密度(microvessel density，MVD)和抑制腫瘤生長(zhǎng)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)k5對(duì)某些高轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞(Bel7402肝癌細(xì)胞、PC-3-M高轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞、PG轉(zhuǎn)移性肺癌細(xì)胞和Lewis肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移株等)的運(yùn)動(dòng)和遷移有明顯的抑制作用，并且在高轉(zhuǎn)移Lewis肺癌腫瘤模型上發(fā)現(xiàn)k5可以抑制Lewis肺癌細(xì)胞自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移。
　　 我們前期的研究

5、還發(fā)現(xiàn)其抗血管增生活性與kringle結(jié)構(gòu)域的完整性(三個(gè)二硫鍵的完整性)密切相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)k5-N端10個(gè)氨基酸缺失突變體的抗血管增生活性更強(qiáng)。而其N端含有5個(gè)的電負(fù)電荷的酸性氨基酸，有文獻(xiàn)報(bào)道Kringle結(jié)構(gòu)域內(nèi)與K5活性相關(guān)的“賴氨酸結(jié)合口袋”—其核心序列RKLYDY含兩個(gè)關(guān)鍵的帶正電荷的精氨酸殘基Arg69和賴氨酸殘基Lys70，去作Arg69和Lys70后，其活性消失。據(jù)于此我們前期的研究通過(guò)點(diǎn)突變技術(shù)將k5-N端5個(gè)酸性氨

6、基酸置換為中性氨基酸蘇氨酸，在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了His標(biāo)簽的k5突變體融合蛋白，結(jié)果在體外實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)該突變體蛋白比k5的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的活性更強(qiáng)。但是該突變體蛋白為融合蛋白，且含有23個(gè)外源氨基酸殘基，這制約了其今后在臨床上的運(yùn)用。
　　 據(jù)于K5在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出顯著抑制血管增生的作用，我們分析K5具備潛在的抑制惡性腫瘤和血管增生相關(guān)疾病的臨床運(yùn)用價(jià)值。但K5完整多肽已獲美國(guó)專利(美國(guó)專利序號(hào)08/83

7、2，087，1997年4月3日，美國(guó)伊利諾伊州艾博特公司)和中國(guó)專利(公開(kāi)號(hào)CN1223690A，1997年7月21日)保護(hù)。因而通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建無(wú)外源氨基酸的K5的突變體不僅可以研究K5結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，也可以制備具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的和具有潛在抑制腫瘤和血管增生性疾病的基因工程藥物。
　　 本研究利用pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)得到去除外源氨基酸的K5突變體，同時(shí)對(duì)K5-N端5個(gè)酸性氨基酸

8、進(jìn)行突變。本研究將在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中分析K5-N端5個(gè)帶負(fù)電的酸性氨基酸殘基與其抗血管增生活性之間的關(guān)系，進(jìn)一步明確K5結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系；同時(shí)為制備具有抑制血管增生和抗腫瘤作用的無(wú)外源氨基酸K5m5基因工程蛋白藥物提供技術(shù)方案。開(kāi)發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的和具有潛在抑制腫瘤和血管增生性疾病的基因工程藥物打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 研究目標(biāo)
　　 1、通過(guò)pGEX-4T-1/BL21(DE3)原核表達(dá)系統(tǒng)獲得去除外源氨基酸的K5突變體

9、k5m5蛋白。
　　 2、體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)無(wú)外源氨基酸的K5突變體k5m5蛋白具有抑制血管增生的活性和抑制裸鼠肝癌實(shí)體瘤的生長(zhǎng)的作用。
　　 研究?jī)?nèi)容與結(jié)果
　　 第一部分：獲得分子量更小、無(wú)外源氨基酸序列、高純度的k5m5蛋白
　　 (1)pGEX-4T-1/k5m5重組質(zhì)粒的構(gòu)建。以我們實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的pET22b(+)/k5mut5cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物(正向引物：CGT GGATCCCCATC

10、TGTATCGACTCCTTCC;反向引物：5'-CCG CTCGAG TCA CGC ACACTG AGG GAC-3')，采用PCR法得到K5m5基因。利用基因工程技術(shù)，將目的基因克隆至pGEX-4T-1的BamHI和XhoI位點(diǎn)。測(cè)序結(jié)果表明目的基因片段與pGEX-4T-1連接無(wú)誤，閱讀框架正確，pGEX-4T-1/k5m5重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 (2)GST-k5m5融合蛋白的表達(dá)、純化。鑒定正確的pGEX-4T-1/

11、k5m5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)宿主菌中，BL21(DE3)/pGEX-4T-1/k5m5工程菌37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6，0.6nmol/l的IPTG25℃低溫誘導(dǎo)6h～10h，表達(dá)出可溶性重組蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌經(jīng)超聲后，離心取上清，用GST親和柱Glutathione Sepharose4B純化，獲得高純度可溶性融合蛋白。對(duì)純化的融合蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western-blot分析鑒定，結(jié)果顯示得到分子量

12、約為37kDa的GST-k5m5融合蛋白。
　　 (3)凝血酶切割GST-k5m5融合蛋白后的再次分離純化。用凝血酶對(duì)融合蛋白進(jìn)行切割，用GST親和柱Glutathione Sepharose4B去除GST標(biāo)簽后，采用超濾方法分離獲得k5m5蛋白。得到的蛋白經(jīng)抗k5血清Western-blot分析顯示有明顯的免疫雜交帶。
　　 第二部分：體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證k5m5蛋白具有抗血管增生活性和抑制裸鼠肝癌實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用

13、>　　 (1)K5m5蛋白特異性地抑制HUVECs的增殖MTT增殖實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)k5m5特異性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)的增殖，并呈明顯的濃度依賴關(guān)系。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)k5m5蛋白比k5蛋白具有更強(qiáng)的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖作用。用80～1280nmol/L k5m5蛋白分別處理正常肝細(xì)胞(chang live cell)、肝癌細(xì)胞(Bel7402)與P

14、BS對(duì)照組細(xì)胞相比，各處理組細(xì)胞存活率變化無(wú)顯著差別。k5m5蛋白對(duì)正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞(Bel7402)的生長(zhǎng)增殖無(wú)明顯作用。間接說(shuō)明K5m5抑制HUVECs的增殖具有特異性。
　　 (2)K5m5蛋白誘導(dǎo)HUVECs凋亡，而對(duì)正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞(Bel7402)無(wú)誘導(dǎo)凋亡的作用
　　 Annexin V-PI雙染法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，流式細(xì)胞儀分析K5m5蛋白誘導(dǎo)HUVECs凋亡，而對(duì)正常肝細(xì)胞、肝癌細(xì)胞(Bel7402

15、)無(wú)誘導(dǎo)凋亡的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為320nmol/L k5m5處理組內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著地高于PBS對(duì)照組，表明k5m5具有誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的作用。而80～1280nmol/L各濃度的k5m5蛋白處理組對(duì)正常肝細(xì)胞和肝癌細(xì)胞(Bel7402)的凋亡與陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，沒(méi)有表現(xiàn)出能明顯誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　 (3)K5m5蛋白抑制裸鼠肝癌(Bel7402)實(shí)體瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)接種Bel7402肝癌細(xì)胞后第24天，肉眼可見(jiàn)PBS

16、對(duì)照組與k5m5處理組及k5處理組裸鼠頸背部皮下腫瘤生長(zhǎng)體積大小出現(xiàn)差異。自腹腔注射k5m5第一次起連續(xù)觀察32天后處死裸鼠，剝瘤稱重，計(jì)算和比較各組瘤均重，結(jié)果顯示：k5m5蛋白及k5蛋白總劑量均為12.5mg/kg時(shí)，對(duì)BALB/c裸鼠肝癌(Bel7402)實(shí)體瘤生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用，抑瘤率分別為68％、63.8％。說(shuō)明k5m5蛋白比k5蛋白具有更強(qiáng)的抑制裸鼠肝癌實(shí)體瘤生長(zhǎng)的效應(yīng)。
　　 (4)K5m5蛋白抑制裸鼠肝癌(B

17、el7402)實(shí)體瘤血管增生采用抗血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34抗體，用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化氫酶(SP免疫組織化學(xué)方法)法進(jìn)行鑒定，DAB顯色，蘇木素染核，棕黃色環(huán)狀物為血管陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果表明K5m5處理組和k5處理組均降低腫瘤組織中微血管的密度(MVD)。但k5m5蛋白處理組的抑制作用更強(qiáng)。
　　 結(jié)論及意義
　　 1、成功構(gòu)建了pGEX-4T-1/k5m5重組質(zhì)粒，并獲得無(wú)外源氨基酸序列的基因工程蛋白k5m5。為其功能研

18、究打下基礎(chǔ)。
　　 2、無(wú)外源氨基酸序列的k5m5蛋白有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的活性。k5m5蛋白具有抑制血管增生性疾病的潛在價(jià)值。
　　 3、無(wú)外源氨基酸序列的k5m5蛋白具有抑制裸鼠肝癌實(shí)體瘤生長(zhǎng)的作用?？梢詾楦伟┑葠盒阅[瘤的治療提供新的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的有效候選基因工程藥物。
　　 4、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)外源氨基酸序列的k5m5蛋白比K5蛋白具有更強(qiáng)的抑制血管增生活性和抑制腫瘤生長(zhǎng)的