家蠶縮蠶突變體突變基因的功能研究.pdf

1、昆蟲是無脊椎動物中節(jié)肢動物門昆蟲綱的動物，它是最繁盛的動物。昆蟲之所以是世界上數量最多的動物物種，這與其行為驚人的適應能力是密不可分的。昆蟲的熱耐受力是昆蟲對環(huán)境適應性的一個重要生理特性。熱的耐受性已在多個昆蟲報道，比如:蝗蟲、粉虱、甲蟲、蛾、螞蟻、果蠅和黃蜂。然而，耐熱的分子機制仍不是很明確。本文選取了家蠶溫度敏感型突變體縮蠶(contraction，cot)為研究對象，該突變是家蠶少有的行為突變體之一?？s蠶突變由單基因控制，呈隱性遺

2、傳，突變基因cot被定位于第15連鎖群的25.0位點。縮蠶幼蟲表型為幼蟲身體粗短，手碰觸后即強度收縮，翻倒，吐消化液，一時不能行動。本文通過對縮蠶突變體的行為進行全面的觀察，鎖定了突變體的突變基因，并利用轉錄組測序的方法，分析了該突變對其它代謝通路的影響。獲得的主要研究結果如下:
　　1.縮蠶突變體的行為觀察
　　為了探明縮蠶突變性狀的誘發(fā)原因，本研究分別利用機械刺激和高溫處理兩種方法進行突變性狀誘導。實驗結果表明:在常溫下

3、用棉簽反復摩擦刺激5齡第5天不同基因型(cot/cot，cot/+和+/+)個體，僅基因型為cot/cot的蠶體出現微弱體節(jié)收縮，但刺激結束后又迅速恢復正常，未能誘發(fā)其突變性狀的產生;cot(cot/cot)品種30℃處理5 min，部分個體產生胸部膨大和體節(jié)縮短的表型;35℃處理5 min后，所有個體產生體節(jié)嚴重縮短、胸部膨大、身體翻滾、吐液，且部分個體會暫時喪失行動能力。cot/+品種則在45℃處理時，雖然也產生縮蠶表型，但其表型比

4、基因型為cot/cot個體弱，10 min處理后全部產生縮蠶表型。正常型Dazao(WT，+/+)即使在52℃處理10 min也沒有產生收縮的表型。結果表明:cot/cot和cot/+基因型個體對溫度的敏感度不同，因此，可以利用高溫處理的方法鑒別cot/cot和cot/+基因型個體;同時由于cot/+基因型個體在45℃處理時產生縮蠶的表型，也表明該突變?yōu)椴煌耆@性突變體。研究還發(fā)現，利用溫度差鑒定的方法處理縮蠶cot(cot/cot)蟻

5、蠶期、幼蟲期（5齡第3天）、蛹期和成蟲期的個體都產生明顯的縮蠶表型。另外，基因型為cotcot個體高溫處理后基本喪失爬行能力，相反正常型Dazao(+/+)受到溫度刺激后，其爬行行為變的十分活躍。這些結果表明，cot的突變性狀主要由溫度誘導產生。因此，cot是一種對溫熱敏感的突變材料，是一個研究昆蟲對環(huán)境溫熱做出快速反應的良好材料。
　　同時，我們還發(fā)現:25℃時，cot/cot ok/ok和+/+okok兩個基因型個體每分鐘心跳

6、次數分別為56.15和54.05;42℃處理3 min后，cot/cot ok/ok和+/+okok兩個基因型個體每分鐘心跳次數增加為86.6和67.25，存在顯著差異，表明高溫處理后cot/cot ok/ok個體心率顯著增加。
　　2.縮蠶突變體的定位克隆
　　為了從分子水平研究縮蠶突變性狀的發(fā)生，本研究利用定位克隆方法對cot基因進行了分離克隆。本研究以cot純合突變（cotcot，♂）和正常型Dazao（+/+，♀）為

7、母本，雜交獲得F1代（cot/cot♀×+/+♂）。利用高溫處理的方法從回交個體中鑒別縮蠶突變表型和正常表型個體共計1255個，其中正常表型個體418個和縮蠶突變個體837個。并將這1255個正常表型個體和突變表型個體用于后續(xù)定位分析。通過初定位和精細定位鎖定縮蠶的突變區(qū)域為SNP19和SNP25，物理距離為268 kb的區(qū)域，該區(qū)域內包含10個預測基因，分別為:BGIBMGA007797、 BGIBMGA007730、 BGIBMGA

8、007796、 BGIBMGA007731、 BGIBMGA007795、BGIBMGA007732、BGIBMGA007733、BGIBMGA007734、BGIBMGA007794和BGIBMGA007735。生物信息學分析表明，BGIBMGA007794基因是編碼跨膜離子通道蛋白的基因，介導了興奮性膜的電壓依賴性鉀離子滲透性，與果蠅的癲癇基因(seizure)高度同源，而且seizure突變體產生類似于cot的表型。我們推測BGI

9、BMGA007794基因可能為縮蠶的突變基因。
　　3.縮蠶突變基因的突變位點鑒定和功能驗證
　　為了研究是否BGIBMGA007794基因（命名為Bmsei）為引起cot突變的基因，本研究首先從mRNA水平進行PCR檢測及測序分析。結果顯示:Bmsei的mRNA在cotcot和cot/+個體中至少存在3種不同的剪切形式。其中，IsoformⅠ的第5外顯子完全缺失，與正常相比，其mRNA的ORF閱讀框在733 nt處提前終止

10、，產生截斷的蛋白，缺少第4、第5、第6跨膜區(qū)、P區(qū)及cNBD結構域;IsoformⅡ序列第5外顯子末端缺少36 bp，翻譯后的蛋白在第5外顯子末端缺少12個氨基酸;IsoformⅢ第5外顯子末端插入54 bp，其ORF閱讀框在853 nt處提前終止導致翻譯的蛋白缺少P區(qū)、第6跨膜區(qū)和cNBD結構域。對Bmsei基因組水平PCR檢測及測序分析的結果表明:cot品種中Bmsei基因的第5內含子發(fā)生了特有的15 bp的缺失，推測該缺失導致了m

11、RNA水平的異常剪切。不同組織表達譜顯示:Bmsei基因主要在cotcot和+/+的頭、前部絲腺、中部絲腺和神經節(jié)中表達。時期表達譜分析表明:Bmsei基因在家蠶胚胎后期、幼蟲期、蛹和成蟲期持續(xù)表達。為了驗證Bmsei基因的分子功能，本研究利用鉀離子阻斷劑研究其對家蠶行為的影響，結果表明，正常型個體的幼蟲期和成蟲期注射鉀離子通道蛋白抑制劑氯化四乙胺(TEA)和氯化鋇(BaCl2)，都產生和縮蠶品種高溫處理后相似表型，暗示縮蠶突變體的突變

12、基因直接或間接與鉀離子通道蛋白相關。在胚胎期，通過注射dsRNA干涉降低Bmsei基因的表達量，可以導致正常型Dazao產生頭部劇烈擺動和吐腸液的現象，這與縮蠶蟻蠶受到高溫刺激后的表型一致。這些結果表明:Bmsei基因為縮蠶的突變基因。選擇化蛾第1天的縮蠶蛾子，分別注射不同濃度的慶大霉素。結果顯示:隨著慶大霉素濃度的增加，縮蠶蛾的翅膀豎立程度越來越弱，并逐漸趨近于水平位置，這與正常型Dazao相似。這些結果表明:隨著濃度的增加，慶大霉素

13、可以部分地恢復縮蠶異常的表型。
　　4.縮蠶突變基因的分子機制初探
　　通過對正常型(+/+)和突變型(cotcot)5齡第5天的神經節(jié)進行組織免疫熒光分析，結果表明:Bmsei蛋白在正常型(+/+)神經節(jié)中表達量很高，而在cot突變體中表達量極低。為了進一步確定該蛋白在神經節(jié)中的表達情況，將正常型Dazao的5齡第5天神經節(jié)石蠟包埋、切片，檢測到Bmsei蛋白在細胞膜和胞質中都有表達。Western blot結果顯示:在常

14、溫和高溫處理條件下，正常型(+/+)、cot/+和cotcot中在100kD附近檢測到兩條條帶，且兩個條帶的表達量在cot/+和cotcot中明顯低于+/+;42℃條件下，該蛋白的兩條條帶在三個品種中都下調表達，其中cot/+和cotcot品種顯著下調，且cotcot中表達量最低。這些結果表明:Bmsei蛋白合成的異?？赡軐е驴s蠶產生異常表型。
　　5.家蠶縮蠶突變體的轉錄組測序及數據分析
　　為了調查縮蠶高溫處理后轉錄組水

15、平的變化，本研究對構建完成的6個樣品的文庫進行了測序分析，文庫依此命名為:cot(cot/cot ok/ok)42℃、cot(cot/cot ok/ok)25℃、ok(+/+ok/ok)42℃、ok(+/+ok/ok)25℃、Dazao(+/++/+)42℃和Dazao（+/++/+）25℃，并進行測序。比較cot(cot/cot ok/ok)、ok(+/+ok/ok)和Dazao(+/++/+)三個品種42℃5 min處理組的樣品與未

16、處理組，分別檢測到147、221和24個差異表達基因，其中12個基因在cot(cot/cot ok/ok)、ok(+/+okok)和Dazao(+/++/+)三個品種都差異表達，30個基因在cot(cot/cot ok/ok)和ok(+/+ok/ok)兩個品種差異表達，19個基因在cot(cot/cot ok/ok)和Dazao(+/++/+)兩個品種差異表達。3個品種的蟻蠶在42℃處理5 min后，有12個共同的差異基因，其中1個未注

17、釋基因顯著下調表達，另外11個注釋為熱激蛋白相關基因且顯著上調表達，表明熱激蛋白在響應高溫應激方面發(fā)揮重要的作用。為了鑒定在高溫(42℃)條件下，cot品種特有的差異表達基因，我們選擇僅在cot品種特有的110個差異基因用于后續(xù)分析。差異基因參與泛素體系、煙堿乙酰膽堿受體的差異表達基因、心臟興奮-收縮偶聯過程、Notch信號通路。這些差異基因可能導致cot品種在受到高溫(＞35℃)處理后表現的體節(jié)異常收縮及心跳增加的現象。這些差異表達基