家蠶Sel突變體候補基因篩選及BmADAR的選擇性拼接研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是鱗翅目（Lepidoptera）模式昆蟲，遺傳背景清晰。目前為止，已經(jīng)被鑒定的家蠶突變體超過600種，其中有200多種被定位于28個連鎖群上。對家蠶體色突變體的研究不僅有助于了解鱗翅目昆蟲色素代謝的相關(guān)基因及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還能為相關(guān)功能基因的利用提供新思路。Sel是家蠶黃浮黃體色突變體，位于24-0.0座位，幼蟲期體色呈現(xiàn)黃色。此前的研究結(jié)果表明，Sel突變體中的墨蝶呤脫氨酶活性高于正常家蠶，且體內(nèi)積累的墨蝶

2、呤脫氨產(chǎn)物亦高于正常家蠶；Sel初步定位的位點與SSR分子標(biāo)記S2404的遺傳距離為12 cM。至今，Sel的分子實質(zhì)尚未得到分離鑒定，人們對Sel所參與的調(diào)控昆蟲色素合成及體色模式形成的分子機制的認(rèn)識非常有限。
　　本文根據(jù)對家蠶遺傳連鎖圖譜的分析，結(jié)合候補基因的功能與Sel突變體的表型相關(guān)性，以家蠶鳥苷三磷酸環(huán)化水解酶（GTP Cyclohydrolase I，GTPCH I）基因、膽色素原脫氨酶（Porphobilinoge

3、n deaminase，PBGD）基因、以及RNA編輯酶--腺苷脫氨酶（Adenosine deaminase acting on RNA，ADAR）基因為Sel候補基因，在野生型和突變型家蠶中分別進行基因克隆、序列比對和表達(dá)模式分析，并對 BmADAR的選擇性拼接進行研究，鑒定了不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)譜特征和可能的自我編輯位點。本文主要獲得如下研究結(jié)果：
　?。?）基因克隆及序列分析表明BmGTPCHIa和BmGTPCHIb編碼的氨基

4、酸序列在p50和U12（Sel/+）之間均沒有差異。不同發(fā)育階段BmGTPCHIb的表達(dá)模式在兩品系間基本一致，組織表達(dá)模式的差異主要在馬氏管。BmGTPCHIb在Sel突變體的馬氏管不表達(dá)，與p50之間存在顯著差異，該基因在馬氏管的功能是否影響Sel突變表型的形成尚需進一步研究探明。
　?。?）基因克隆及序列分析表明BmPBGD編碼的氨基酸序列在p50和U12（Sel/+）之間有4個氨基酸位點差異，但F2代分離個體的測序結(jié)果表明

5、該4個位點并沒有與Sel連鎖。p50和U12（Sel/+）的BmPBGD在不同發(fā)育時期的表達(dá)模式基本相同，然而，該基因5齡幼蟲不同組織的表達(dá)模式在兩品系之間多處存在明顯差異。Sel突變體在頭部較高表達(dá)BmPBGD是否為該突變體內(nèi)脫氨酶活性高于正常蠶的原因尚待深入研究。
　?。?）利用RT-PCR和RACE首次全面克隆并獲得了BmADAR的多種轉(zhuǎn)錄類型，成功獲得了2個具有完整ORF序列的轉(zhuǎn)錄本和4個沒有終止密碼子的轉(zhuǎn)錄本，分別編碼氨

6、基端或羧基端各有差異的6種亞型。4個沒有終止密碼子的轉(zhuǎn)錄本的共同特征是在終止密碼子TAG處發(fā)生了A-to-I的自我編輯。2個具有完整ORF的轉(zhuǎn)錄本的基因結(jié)構(gòu)分析說明，BmADAR mRNA在成熟的過程中發(fā)生了選擇性拼接。時空表達(dá)模式結(jié)果表明，家蠶主要表達(dá)BmADARa亞型。
　　（4）家蠶基因組數(shù)據(jù)庫信息的查詢結(jié)果顯示，BmADARa由19個外顯子、18個內(nèi)含子構(gòu)成，編碼717 aa。同源序列比對及保守性分析表明，BmADARa和

7、果蠅等昆蟲 ADAR一樣，屬于脊椎動物 ADAR2的同系物。據(jù)報道利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)純化的ADAR不具有酶活性。為了研究BmADARa的酶活性特點，我們進行了該酶蛋白的原核表達(dá)研究，有助于今后對該酶進行大量表達(dá)、純化和鑒定體外酶活特性。
　　綜上，BmADAR在Sel突變體里的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式有待于進一步研究鑒定，目前尚不能排除BmGTPCH、BmPBGD以及BmADAR與Sel之間存在相關(guān)性。因為非翻譯區(qū)的突變，特別是啟動子的