應用TALEN技術敲除斑馬魚IDH基因及突變體篩選.pdf

1、異檸檬酸脫氫酶(IDH)是三羧酸循環(huán)中異檸檬酸被催化生成α-酮戊二酸的限速酶。
　　idh1基因位于斑馬魚9號染色體上，在ensembl數(shù)據(jù)庫中有兩個轉錄本idh1-201和idh1-202。idh1-201含有9個外顯子，轉錄本長度1995bp，編碼429個氨基酸。idh1-202含有10個外顯子，轉錄本長度1977bp，編碼423個氨基酸。idh2基因位于斑馬魚18號染色體上，在ensembl數(shù)據(jù)庫中含有兩個轉錄本idh2-2

2、01和idh2-202。idh2-201有24個外顯子，轉錄本長度1650bp，編碼450個氨基酸。idh2-202有16個外顯子，轉錄本長度1641bp，編碼447個氨基酸。idh3基因位于斑馬魚23號染色體上，在ensembl有3個轉錄本idh3-201，idh3-003和idh3-001。idh3-201有13個外顯子組成，轉錄本長度2475bp，編碼391個氨基酸，idh3-003有14個外顯子組成，轉錄本長度2470bp，編碼

3、391個氨基酸，idh3-001有5個外顯子組成，轉錄本長度1565bp，編碼66個氨基酸。
　　IDH3由2個α亞基，一個β亞基和一個γ亞基組成了異源四聚體，在癌變過程中IDH3起了關鍵性的作用。但是在造血方面暫時還沒有idh3基因發(fā)生突變的報道，因此在此文中idh3基因不是我們研究的重點。有研究發(fā)現(xiàn)人膠質母細胞瘤中發(fā)生了idh1和idh2基因的突變，并且在骨髓增生異常綜合征(MDS)、骨髓及外骨髓增生腫瘤(MPN)、慢性髓單核

4、細胞白血病(CMML)、急性髓系細胞白血病(AML)和淋巴腫瘤中也檢測到IDH發(fā)生了突變。idh1和idh2基因一般發(fā)生雜合突變，在血液疾病中IDH發(fā)生最常見的突變是單個氨基酸的突變。在大部分病人中發(fā)現(xiàn)IDH1蛋白發(fā)生的突變位點常常在翻譯生成的肽鏈序列的第132號位點發(fā)生，132號位點的精氨酸突變成了組氨酸(R132H)，IDH1蛋白發(fā)生正常作用時形成的是同源二聚體，產生的α-酮戊二酸被PHD所利用，促進缺氧誘導因子(HIF-1α)發(fā)生

5、加羥基作用，隨后發(fā)生降解，在腫瘤細胞中IDH1蛋白一個亞基發(fā)生突變，形成了無正常功能的蛋白，缺氧誘導因子不能產生加羥基作用，不能發(fā)生降解，隨后誘導一些腫瘤相關的因子產生，像葡萄糖運輸因子1(Glut1)、血管內皮生長因子（VEGF）、磷酸甘油酸激酶(PGK1)，這些因子促使腫瘤細胞發(fā)生大量增殖，這也提示idh1基因更可能的功能是腫瘤抑制基因而不是原癌基因。
　　IDH2則是在翻譯生成的蛋白序列第140個氨基酸和第172個氨基酸發(fā)生

6、突變，140號位的精氨酸突變生成了谷氨酰胺(R140Q)，172號位的精氨酸突變生成了賴氨酸(R172K)。突變的IDH1/2導致異檸檬酸生成α-酮戊二酸的過程發(fā)生了阻礙，正常的α-酮戊二酸生成量降低，轉而生成了大量的不正常產物D-二羥基戊二酸。因此二羥基戊二酸可以作為檢測IDH1/2突變導致的血液疾病標記物。
　　除了IDH1/2突變直接影響外，該基因還通過影響某些基因的甲基化，引起特定通路中相關基因的表達或抑制間接引起疾病。體

7、外實驗中，IDH1/2突變體白細胞表達增多，這癥狀與tet2缺失導致的干細胞標志物增多和髓系細胞分化減少是一致的。IDH1/2突變使tet2的功能受影響，從而影響tet2維持和造血相關的基因的甲基化。IDH1/2突變的小鼠表現(xiàn)出5hmC水平的大量降低。這個現(xiàn)象說明D-二羥基戊二酸生成抑制了tet2蛋白的活性。正常細胞中IDH1/2催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸，tet2在α-酮戊二酸的作用下招募DNA去甲基化酶使某個基因啟動子位點發(fā)生去甲

8、基化作用，DNA轉錄相關的因子便結合在該位點，引起基因發(fā)生轉錄，使基因行使表達功能。當IDH發(fā)生突變，生成了D-二羥基戊二酸，這個時候tet2便不能招募DNA去甲基化酶，基因啟動子位點的DNA甲基化酶占有主導地位，使該位點持續(xù)甲基化，這個時候基因便不能轉錄，即不能表達出功能，使基因發(fā)生沉默。假如該基因是維持生命活動的重要基因，便會使人產生疾病。
　　通過比對人、小鼠、斑馬魚的IDH1/2基因，我們可以看到它們的基因還是相當保守的，

9、比如說IDH1蛋白肽鏈132位點，IDH2蛋白肽鏈的140和172位點。大量的細胞實驗、敲除小鼠IDH1和IDH2保守位點實驗以及一些血液疾病的臨床病人樣本檢測都發(fā)現(xiàn)IDH1/2突變是導致造血異常的一種致癌基因。但是還沒有一個好的模型能夠來研究idh1/2基因突變導致的血液疾病，斑馬魚由于自身的生物學優(yōu)勢，能夠很好的回答idh1/2基因突變造成的造血異常，因此被用來研究血液疾病。這篇文章主要想通過Talen的方法敲除斑馬魚中的idh1和

10、idh2基因，篩選出突變的斑馬魚，檢測造血的淋系，髓系，紅系等各個譜系，建立造血異常的斑馬魚突變疾病模型。
　　基因敲除是證明基因功能不可缺少的邏輯環(huán)節(jié)，是基因工程和基因治療的重要手段，常見的基因敲除方法有自殺質粒，RNAi，ZFN（鋅指核酸酶），但是自殺質粒這種敲除方法同源重組幾率低，操作難度大，RNAi是一種臨時性的敲除方法，不能穩(wěn)定遺傳下去。ZFN設計依賴上下游序列、脫靶率高、具有細胞毒性，且只能在體外操作，再輸回病人體內，

11、操作復雜，容易引起免疫反應，因此難以推廣使用。這個時候我們就需要一種新的敲除方法，Talen敲除方法就避免了以上幾種敲除方法的缺點。該方法基于Talen(transcription activator-like(TAL) effector nucleases）靶向基因敲除，原理是Talen真核表達載體表達一個重組核酸酶，在靶點識別結構域的作用下，識別靶點核酸序列，核酸酶發(fā)揮內切酶活性，打斷目的基因，觸發(fā)DNA同源重組或非同源末端連接，重

12、組過程中發(fā)生修復錯誤就導致了基因發(fā)生突變，從而達到基因敲除的目的。
　　1989年，植物病原體黃單胞菌屬（Xanthomonas spp.）avrBs3基因被克隆，2007年發(fā)現(xiàn)其序列特異性核酸結合特性，avrBs3-TA，2009年XanthomonasTA氨基酸序列與核酸靶序列的對應關系被破譯:由34個aa重復序列組成一個單元，重復17-18次;34個氨基酸中的第12和13個氨基酸(Repeat Variant Di-resi

13、due，RVD)對應識別一個目標堿基。RVD與堿基A、G、C、T有恒定的對應關系，即NI識別A，NG識別T，HD識別C，NN識別G，欲使Talen特異識別某一核酸序列，只須按照靶點序列將相應TAL單元（14-18個）串聯(lián)克隆即可。
　　Talen基因敲除基本步驟主要包括:1.確定靶點:選擇目標基因外顯子中相隔17-18bp的兩段14-18bp序列作為靶點;2.TAL靶點識別域的克隆構建;3.將TAL靶點識別域克隆入特定的真核表達載

14、體;4.將重組真核表達質粒轉錄生成的mRNA顯微注射進斑馬魚單細胞受精卵中以表達重組核酸酶，敲除基因;5.篩選突變體。目前TALEN系統(tǒng)利用Fok1的內切酶活性打斷目標基因。因Fok1需形成二聚體方能發(fā)揮活性，在實際操作中需在目標基因中選擇兩處相鄰（間隔17堿基）的靶序列（14-18個堿基）分別進行TAL識別模塊構建。當構建好的Talen表達載體注射入斑馬魚的胚胎中，下一步我們要做的就是檢測敲除效率，篩選出突變體。我們可以利用實驗設計時

15、挑選的，位于相鄰靶位點之間的特異性內切酶位點，進行PCR產物酶切鑒定以篩選發(fā)生目標基因敲除的突變個體。當左右靶點之間沒有合適的酶切位點時可使用CEL-Ⅰ核酸酶檢測。由于通過單元組裝法能夠構建任何序列的識別蛋白，因此從理論上來說TALEN技術可以敲除任何基因。
　　本文通過TALEN技術敲除異檸檬酸脫氫酶基因，獲得該基因突變的斑馬魚，初步探討不同突變類型的斑馬魚突變體是否能夠導致某些造血方面的表型出現(xiàn)。本文分為實驗材料，實驗方法，結

16、果與分析，討論及全文總結，展望5部分。
　　目的:
　　通過人工構建Talen靶向敲除載體敲除idh1/2基因，篩選出突變體，并進行一些造血方面相關譜系表型鑒定。
　　方法:
　　采用單元組裝法構建靶向敲除idh1/2基因的載體，通過試劑盒在體外轉錄成Talen mRNAs，通過顯微注射方法注入單細胞時期的受精卵中，胚胎期檢測Talen敲除效率，再通過剪尾、PCR、酶切、測序篩選出發(fā)生基因突變的成年斑馬魚及突變的

17、類型，然后通過斑馬魚胚胎整體原位雜交，實時熒光定量PCR，吉姆薩染色，蘇丹黑B染色鑒定突變的斑馬魚造血相關表型。
　　結果:
　　構建完成的TALEN載體，PCR及酶切發(fā)現(xiàn)插入了組裝的TALE序列。顯微注射進斑馬魚胚胎中，檢測效率達到預期。將敲除有效率的斑馬魚養(yǎng)大，剪尾，提DNA，PCR酶切跑膠，測序證實成功構建了idh1/2突變的斑馬魚，并且在各種突變類型的斑馬魚中暫時沒有發(fā)現(xiàn)與造血相關表型出現(xiàn)，猜想idh1/2基因突變導

18、致的造血異?？赡苁嵌喾N基因相互作用結果，需要進一步找到與idh1/2基因相互作用的基因。
　　結論:
　　成功構建idh1/2基因敲除的斑馬魚動物模型，為進一步研究人類idh1/2基因突變引起的血液疾病發(fā)病機制提供了良好的動物模型。由于造血作用是一個復雜的過程，想完全弄明白還是一個具有挑戰(zhàn)的事情，我們只能初步模擬idh1/2基因在人類中目前已經發(fā)現(xiàn)的與造血相關的突變位點，期望弄清楚idh1/2突變導致血液疾病如白血病的機制。