利用TALENs技術(shù)構(gòu)建zfol基因的斑馬魚突變體.pdf

1、凝集素廣泛存在于動、植物體內(nèi),具有多種生物活性,在魚類胚胎發(fā)育早期,各組織還未完全發(fā)育之時,對外界病原體仍然有一定的抵御能力,這種抵御能力來自自身非特異性免疫和母源性免疫,而存在于卵母細(xì)胞中的凝集素等物質(zhì)被認(rèn)為是來自母體的免疫物質(zhì),并且極有可能在魚類胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用(王志平,2008)。對母源凝集素的研究,有利于對凝集素在魚類胚胎發(fā)育過程中所扮演的角色進(jìn)行深入了解,以期為魚類免疫機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　在本研究中,首先

2、我們克隆得到了斑馬魚母源凝集素基因zfol,cDNA全長為937bp,包含一個771bp的開放閱讀框(ORF),編碼256個氨基酸,長73bp的5’非編碼區(qū)(5’-UTR,5’-untranslatedregion),長93bp的3’非編碼區(qū)(3’-UTR,3’-untranslatedregion)。通過RT-PCR和western-blot對其進(jìn)行了mRNA水平和蛋白水平的時空表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)zfol在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中呈現(xiàn)出動態(tài)變

3、化,在斑馬魚胚胎發(fā)育初期,zfolmRNA表達(dá)量較高,隨著胚胎的不斷發(fā)育,zfol的
　　mRNA表達(dá)量有所下降,到后期表達(dá)量又上升;斑馬魚成魚各組織中mRNA水平,除了精巢不表達(dá)外,在成魚肝臟、腎臟、卵巢、腦、心臟中均有表達(dá),且表達(dá)量相當(dāng)。而Zfol蛋白在卵巢中表達(dá)量最高,腎臟中也有表達(dá),但是表達(dá)量相對較低,而在肝臟、腦、精巢、心臟這些組織中均不表達(dá);在胚胎發(fā)育0到4小時時蛋白的表達(dá)量較高,6~9小時蛋白表達(dá)量下降,12~16小

4、時蛋白表達(dá)量又再上升,20~24小時下降,到36小時蛋白表達(dá)量升高,而后Zfol蛋白的表達(dá)量又下降。為了進(jìn)一步研究zfol基因在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中所扮演的角色,我們選擇基因敲除技術(shù)來研究zfol的功能,構(gòu)建zfol基因的斑馬魚突變體,在現(xiàn)有的基因敲除技術(shù)中,又以TALENs技術(shù)最具優(yōu)勢,能夠?qū)δ康幕虻奶禺愋蛄羞M(jìn)行誘變,且突變率高,與其他技術(shù)相比,優(yōu)勢明顯,故在本研究中我們采用TALENs技術(shù)對zfol進(jìn)行誘變,達(dá)到敲除zfol基因的

5、目的。利用TALENs技術(shù),通過設(shè)計(jì)能夠特異性識別zfol目標(biāo)序列的TALENs,誘導(dǎo)zfol目標(biāo)序列產(chǎn)生插入或缺失突變,從而導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止,起到敲除zfol基因的作用,構(gòu)建zfol的突變體。通過對zfol基因的斑馬魚突變體進(jìn)行研究,初步了解zfol在斑馬魚胚胎生長發(fā)育過程中發(fā)揮的功能。對zfol斑馬魚突變體的生長發(fā)育過程進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn),缺失zfol后的斑馬魚發(fā)育較緩慢,同時對其表型進(jìn)行分析表明,圍心腔處有輕微膨大的現(xiàn)象,這些結(jié)果暗