Cas9介導(dǎo)的線粒體tRNA核修飾基因gtpbp3,mto1和trmu的斑馬魚突變體構(gòu)建.pdf

1、在人類細(xì)胞中，GTPBP3，MTO1和TRMU是由核基因編碼的，但進入線粒體發(fā)揮功能的3種具有酶活性的蛋白，他們共同參與線粒體tRNAs U34位點的5-牛磺酸甲基-2-硫尿嘧啶（τm5S2U）修飾。其中GTPBP3和MTO1以形成α2β2異源四聚體的方式共同參與線粒體tRNA Leu（UUR)和tRNATrp U34位點的5-?；撬峒谆蜞奏ぃé觤5U）修飾;TRMU從另外的一條路徑與GTPBP3，MTO1一起但又獨立的完成線粒體tR

2、NALys，tRNAGlu和tRNAGln U34位點的τm5S2U修飾。
　　已有報道證明:GTPBP3，MTO1和TRMU的突變在人體中可導(dǎo)致相關(guān)的線粒體疾病的發(fā)生（GTPBP3突變可導(dǎo)致肥厚性心肌病、乳酸酸中毒和腦病，MTO1突變可導(dǎo)致肥厚性心肌病和乳酸酸中毒，TRMU突變可導(dǎo)致急性的嬰兒肝功能衰竭）。
　　并且，最近在人類細(xì)胞中的研究表明:除了線粒體tRNA的修飾功能外，MTO1有可能會參與線粒體核糖體蛋白的組裝過程

3、;TRMU可能參與富含鐵-硫簇的酶復(fù)合體(如呼吸鏈復(fù)合體Ⅱ)的組裝。
　　為了在模式生物中更好的揭示3基因突變導(dǎo)致的相關(guān)線粒體疾病的致病機理以及組織特異性發(fā)病機制，我們在斑馬魚中對gtpbp3，mto1和trmu進行了生物信息學(xué)以及時空表達譜分析，并且利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了3基因的突變體。
　　物種間同源比對分析顯示:三種蛋白的氨基酸序列在多種物種間均是相對保守的，其中在斑馬魚和人類之間的同源性均在60％以上。

4、而且三種蛋白中的很多重要功能域在不同物種間也是高度同源保守的。
　　qRT-PCR顯示gtpbp3，mto1和trmu基因在成魚各種器官中廣泛表達，在卵巢里含量尤其多;在新陳代謝旺盛的組織表達量也較高，比如眼睛、心臟、腎臟等。對gtpbp3的進一步研究發(fā)現(xiàn)，在未受精的卵子中可以檢測到其高度的mRNA和蛋白水平，而且該基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中均有表達。這些結(jié)果顯示三基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮著重要功能，而且對于成魚

5、中那些ATP需求量較高的組織是相對重要的。
　　利用CRISPR/Cas9技術(shù)，我們得到了gtpbp3基因的gtpbp3Δ14bp和gtpbp3Δ13bp兩種突變體類型;mto1基因的mto1Δ7bp和mto1Δ8bp兩種突變體類型以及trmu基因的trmu+32bp一種突變體類型。除gtpbp3Δ14bp之外，其他的突變類型均會導(dǎo)致相應(yīng)基因的移碼突變和提前終止突變，從而成功的實現(xiàn)了三基因的敲除。
　　因此，我們在斑馬魚中成