斑馬魚倍增基因igfbp-1a-igfbp-1b突變體的構建以及在脅迫條件下的表達差異和響應機制的研究.pdf

1、IGFBP-1是IGF結合蛋白家族中第一個被發(fā)現(xiàn)和鑒定的成員，一些分解代謝脅迫條件（如禁食、營養(yǎng)不良、蛋白質限制）能夠誘導IGFBP-1 mRNA的高量表達。體外實驗表明，缺乏單一氨基酸（如精氨酸、半胱氨酸、精氨酸等）能夠誘導IGFBP-1的表達。其它分解代謝脅迫條件包括ER(endoplasmic reticulum)脅迫以及低氧也能夠調節(jié)IGFBP-1的表達。目前已經(jīng)克隆得到斑馬魚（Danio rerio）的igfbp-1具有兩個倍

2、增基因，命名為igfbp-1a和igfbp-1b，是人類IGFBP-1的直系同源基因。系統(tǒng)進化分析和共線性數(shù)據(jù)表明硬骨魚類的進化經(jīng)歷了2R(the twobasal vertebrate tetraploidization)和3R(the third tetraploidization)基因組倍增，這為基因功能進化的進程研究提供了有利的條件。倍增基因在功能上是否存在差異以及存在哪些差異有待進一步研究。研究已經(jīng)揭示igfbp-1a、igf

3、bp-1b受饑餓以及低氧等因素調控，但脅迫條件下IGFBP-1對IGF功能的抑制以及對環(huán)境變化的快速反應之間的作用關系還沒有得到深入的研究，并且之前所有報道均未揭示igfbp1a、igfbp-1b受饑餓調節(jié)的發(fā)生機制。
　　我們分析發(fā)現(xiàn)igfbp-1a含有兩個保守的AARE元件，其中一個位于轉錄起始位點上游-1454/-1446區(qū)域:TGATGCAAC;另一個位于第一個內含子的+483/+491區(qū)域:ATTTCATCA。但我們在i

4、gfbp-1b中并沒有發(fā)現(xiàn)類似的AARE保守序列。為了確定AARE對氨基酸缺乏是否有響應，我們用pGL3-basic、p1128Luc、p2025Luc報告質粒在HepG2細胞中進行啟動子響應活性的檢測，實驗結果表明斑馬魚igfbp-1a轉錄起始位點上游的AARE元件對亮氨酸缺乏有響應。ZF4細胞中亮氨酸缺乏實驗結果表明，亮氨酸缺乏對igfbp-1amRNA的表達沒有上調作用，在ZF4細胞中沒有檢測到igfbp-1b的表達。我們制備了斑

5、馬魚Igfbp-1a、Igfbp-1b的多克隆抗體，檢測結果顯示二者均具有良好的特異性和較高的效價，可以用于斑馬魚Igfbp-1a和Igfbp-1b的蛋白檢測。蛋白檢測結果顯示，在ZF4細胞中，亮氨酸缺乏對Igfbp-1a與Igfbp-1b的表達沒有影響。
　　本文中我們采用TALENs和CRISPR/Cas9技術對斑馬魚倍增基因igfbp-1a、igfbp-1b基因進行敲除，得到了純合敲除突變體。igfbp-1a、igfbp-1