利用復(fù)制干擾突變構(gòu)建具有抗HBV作用的顯性陰性突變體研究.pdf

1、目的:慢性HBV感染是中國的常見病,迄今尚無滿意療法.基因治療是抗病毒治療研究的熱點(diǎn),獲得高效靶向性導(dǎo)入載體是基因治療的關(guān)鍵.HBV具有天然嗜肝特性,能在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制,反復(fù)感染,病毒本身對細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性.HBV具有作為肝靶向性基因治療載體的基本條件,與其它病毒載體相比,理論上具有明顯優(yōu)勢:它可以利用乙肝患者這個(gè)天然"包裝細(xì)胞",將目的基因的嗜肝性及抗HBV作用在慢性HBV感染者體內(nèi)長期保持及放大;放HBV復(fù)制水平下降時(shí),重組HB

2、V也將隨之減少或消失,有可能從根本上克服目前治療載體的缺陷.該課題對HBV基因組作了三種類型改造:(1)構(gòu)建C基因截短型HBV載體;(2)構(gòu)建包膜蛋白突變的HBV載體;(3)構(gòu)建核心蛋白和包膜蛋白聯(lián)合突變HBV載體,在細(xì)胞和分子水平上觀察它們的抗HBV作用,同時(shí)探討adw亞型C基因截短型HBV載體在ayw亞型缺失包裝信號輔助質(zhì)粒輔助下的復(fù)制和包裝.方法:1、以野生型HBV質(zhì)粒adwR9為骨架,構(gòu)建C基因截短型、野生型C基因真核表達(dá)載體p

3、cDNA3-ΔC(缺失核心蛋白的118-183aa)、pcDNA3-C和C基因截短型HBV載體pHBV-ΔC(缺失2256-2299nt).應(yīng)用脂質(zhì)體分別將pcDNA3-ΔC和pcDNA3-C轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,48小時(shí)后提取胞內(nèi)蛋白,采用Western blot檢測蛋白表達(dá).2、以野生型HBV質(zhì)粒adwR9為骨架,通過定點(diǎn)突變構(gòu)建包膜蛋白突變HBV載體pHBV-mS1(preS1區(qū)羧基端的13aa中,pro和leu密碼子突變成Arg)

4、、pHBV-mS(S loop56-59aa P→L T→I S→F N→S)和pHBV-mS1S.在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建S基因突變型和野生型S基因真核表達(dá)載體pcDNA3-mS和pcDNA3-S.應(yīng)用脂質(zhì)體將pcDNA3-mS和pcDNA3-S分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,采用ELISA方法檢測培養(yǎng)上清和胞內(nèi)S抗原,采用Western blot檢測胞內(nèi)蛋白的表達(dá).將pcDNA3-mS和pcDNA3分別與adwR9共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,采用ELIS