家蠶內(nèi)層卵殼蛋白及蠶卵致死突變體(l-em)突變機(jī)理研究.pdf

1、卵子發(fā)生過(guò)程是昆蟲(chóng)繁衍及種群維持的關(guān)鍵生理過(guò)程。昆蟲(chóng)卵子發(fā)生將依次經(jīng)歷前卵黃生成期、卵黃生成期、卵殼生成期、及排卵和受精期等發(fā)育階段。
　　 昆蟲(chóng)卵殼主要成分為蛋白質(zhì)，由卵巢組織中的特殊分泌型細(xì)胞-濾泡上皮細(xì)胞，于卵殼生成期分泌附著在卵細(xì)胞表面的一個(gè)復(fù)雜胞外結(jié)構(gòu)層。昆蟲(chóng)卵殼包括外層卵殼層和內(nèi)層卵殼層（也稱(chēng)為卵黃膜層）兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)層，行使保護(hù)胚胎免受機(jī)械損傷和微生物侵染、防止水分喪失、維持氣體交換、參與胚胎極性形成等重要功能。卵

2、殼結(jié)構(gòu)及其功能是昆蟲(chóng)生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　 昆蟲(chóng)間卵殼蛋白的差異性，使得卵黃膜層結(jié)構(gòu)蛋白（也稱(chēng)為卵黃膜蛋白）的研究長(zhǎng)期局限于雙翅目昆蟲(chóng)中，這種研究狀態(tài)與卵殼多樣性及生理功能重要性不相匹配。此外，昆蟲(chóng)胞外卵殼結(jié)構(gòu)層的分泌組裝過(guò)程;不同昆蟲(chóng)卵黃膜蛋白的構(gòu)成、序列特征、序列的保守性及差異性;卵黃膜蛋白編碼基因的表達(dá)特征、編碼基因在基因組中的分布特征等都是一系列未知的生物學(xué)問(wèn)題。
　　 本研究以鱗翅目模式昆蟲(chóng)-家蠶為研究對(duì)

3、象，構(gòu)建家蠶卵巢及蠶卵蛋白質(zhì)圖譜，通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析卵子發(fā)生過(guò)程中卵巢及蠶卵的蛋白質(zhì)組成及變化情況，鑒定獲取發(fā)育時(shí)期相關(guān)的特征蛋白質(zhì)。篩選家蠶及其它鱗翅目昆蟲(chóng)卵黃膜蛋白及其編碼基因，比較分析不同昆蟲(chóng)卵黃膜蛋白序列的保守性與差異性，并以家蠶卵黃膜蛋白-BmEP80為代表，結(jié)合相應(yīng)的蠶卵致死突變體(l-em)，對(duì)鱗翅目昆蟲(chóng)卵黃膜蛋白進(jìn)行功能研究。主要獲得如下研究結(jié)果:
　　 1、家蠶蠶卯和卵巢組織蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　

4、 昆蟲(chóng)卵子發(fā)生的基本功能單元為濾泡。在家蠶中，濾泡發(fā)育主要在蛹期完成，家蠶濾泡發(fā)育具有典型的次序性（也稱(chēng)為不同步性），即卵巢管中依次排列著不同發(fā)育階段的濾泡，相鄰濾泡發(fā)育間隔2～2.5h。
　　 本研究獲取家蠶Dazao（野生型）化蛹7天卵巢組織、Dazao24h和48h受精卵、Dazao24h和48h非受精卵、滯育性Dazao受精卵、非滯育性Dazao受精卵、Dazao蠶卵卵殼、Dazao蠶卵內(nèi)容物、以及家蠶小卵突變種（em

5、i、sm、sm-2）化蛹7天卵巢組織，抽提蛋白質(zhì)，經(jīng)雙向電泳分析，獲取相應(yīng)的雙向電泳圖譜。選取Dazao化蛹7天卵巢組織及Dazao24h受精卵的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，挖取豐度較高的蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定分析，分別鑒定獲得33和42個(gè)不同的蛋白質(zhì)，構(gòu)建了家蠶蛹期卵巢組織及家蠶早期胚胎期蠶卵的蛋白質(zhì)圖譜。
　　 比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析Dazao24h和48h受精卵、及24h和48h非受精卵卵蛋白的雙向電泳圖譜，獲得與蠶卵

6、受精及早期胚胎發(fā)育相關(guān)的5個(gè)特征蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定發(fā)現(xiàn)，其中兩個(gè)特征蛋白質(zhì)為本研究在家蠶中首次鑒定獲得，分別命名為BmEP80和Peritrophin-like27。BmEP80合成于家蠶蛹期卵巢組織，之后存儲(chǔ)于蠶卵中，蠶卵受精后BmEP80將消失。基于上述特征，推測(cè)BmEP80為家蠶內(nèi)層卵殼結(jié)構(gòu)蛋白。Peritrophin-like27含有三個(gè)ChitinbindingPeritrophin-A結(jié)構(gòu)域，于蠶卵受精4

7、8h后出現(xiàn)。推測(cè)家蠶早期胚子形成過(guò)程中，Peritrophin-like27可能作為一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白參與某一組織或器官的形成。
　　 本研究通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，獲得滯育性受精卵與非滯育性受精卵卵蛋白的差異蛋白點(diǎn)，以及家蠶Dazao與家蠶小卵突變種卵巢組織蛋白質(zhì)的差異蛋白點(diǎn)。上述差異蛋白質(zhì)的鑒定與分析，對(duì)家蠶蠶卵滯育的形成以及家蠶小卵突變的研究提供了一些參考數(shù)據(jù)。
　　 2、家蠶BmEP80表達(dá)特征及功能研究
　　

8、 家蠶蠶卵比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，BmEP80疑似為家蠶內(nèi)層卵殼蛋白，基因組基因預(yù)測(cè)信息顯示BmEP80為單外顯子基因編碼的大分子量蛋白質(zhì)。本研究對(duì)BmEP80及其編碼基因的表達(dá)模式和功能開(kāi)展相關(guān)分析。
　　 基因表達(dá)特征顯示:BmEP80特異表達(dá)于家蠶蛹中后期的卵巢組織;不同發(fā)育時(shí)期濾泡檢測(cè)結(jié)果顯示，BmEP80表達(dá)于卵黃生成期后期至卵殼生成期早期的濾泡中，高量表達(dá)區(qū)間為-5～+10;原位雜交結(jié)果顯示，BmEP80由濾泡上皮細(xì)

9、胞所表達(dá)，卵細(xì)胞不表達(dá)BmEP80。
　　 Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)特征顯示，BmEP80開(kāi)啟表達(dá)于～-10期濾泡;蠶卵不同組分蛋白質(zhì)雙向電泳分析顯示，蠶卵中的BmEP80分布于卵殼結(jié)構(gòu)中，而蠶卵內(nèi)容物無(wú)此蛋白;家蠶蠶卵卵殼免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，BmEP80定位于一個(gè)狹窄的卵殼結(jié)構(gòu)層中，該結(jié)構(gòu)層位于小脊柱層和卵黃膜層之間。上述結(jié)果證實(shí)BmEP80為家蠶一個(gè)大分子量?jī)?nèi)層卵殼蛋白編碼基因，BmEP80基因及蛋白的表達(dá)模式均

10、符合昆蟲(chóng)內(nèi)層卵殼蛋白的特征。
　　 本研究使用RNA干涉方法研究家蠶BmEP80的功能，BmEP80siRNAs注射干涉后，蛹期卵巢組織中該基因表達(dá)受到瞬時(shí)抑制，相應(yīng)蠶卵卵殼中BmEP80蛋白含量下降約20％。BmEP80RNA干涉不影響濾泡后續(xù)發(fā)育過(guò)程，以及個(gè)體化蛾、交配產(chǎn)卵行為。卵殼中BmEP80降低使得蠶卵在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)生三角形凹陷，表明BmEP80作為家蠶內(nèi)層卵殼層的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，行使維持卵殼結(jié)構(gòu)完整的功能，并且推測(cè)

11、與蠶卵卵殼保水功能相關(guān)。
　　 3、鱗翅目昆蟲(chóng)卵黃膜蛋白編碼基因預(yù)測(cè)、表達(dá)特征及功能域分析
　　 昆蟲(chóng)卵黃膜蛋白的研究局限于雙翅目昆蟲(chóng)。雙翅目昆蟲(chóng)之外，僅在家蠶中鑒定報(bào)道過(guò)一個(gè)卵黃膜蛋白-BmVMP30。序列比對(duì)分析顯示BmVMP30與雙翅目昆蟲(chóng)卵黃膜蛋白不存在序列相似性。
　　 黑腹果蠅卵黃膜蛋白編碼基因（VM26Ab，VM26Ac和VM26Aa）成簇分布于2號(hào)染色體左臂26A位點(diǎn)處，基于對(duì)此特征的思考，本研究

12、在BmEP80側(cè)翼基因組序列上鑒定出3個(gè)預(yù)測(cè)卵黃膜蛋白編碼基因，表明家蠶基因組中也存在類(lèi)似的卵黃膜蛋白編碼區(qū)。該區(qū)域中預(yù)測(cè)卵黃膜蛋白編碼基因依次命名為:BmVMP25(-)、BmVMP23(+)、BmEP80(+)、BmVMP30.1(+)?；虮磉_(dá)特征分析結(jié)果顯示，BmVMP25、BmVMP23及BmVMP30.1均表現(xiàn)為蛹期卵巢組織特異表達(dá)，并且表達(dá)于卵殼生成期早期之前的濾泡。預(yù)測(cè)基因的表達(dá)模式符合昆蟲(chóng)卵黃膜蛋白編碼基因的表達(dá)特征。

13、
　　 煙草天蛾、帝王蝶、紅帶袖蝶基因組測(cè)序公布后，本研究進(jìn)行tBlastn檢索分析，發(fā)現(xiàn)已測(cè)序鱗翅目昆蟲(chóng)基因組中均存在卵黃膜蛋白編碼區(qū)域，編碼區(qū)域內(nèi)分別鑒定到卵黃膜蛋白編碼基因4個(gè)、3個(gè)和4個(gè)，并且基因排列方式相一致，即第一個(gè)預(yù)測(cè)基因由負(fù)義鏈編碼，之后預(yù)測(cè)基因由正義鏈編碼。本研究揭示卵黃膜蛋白編碼基因成簇排布特征在鱗翅目昆蟲(chóng)和雙翅目昆蟲(chóng)間是保守的。
　　 基于序列差異性，本研究將已鑒定鱗翅目昆蟲(chóng)卵黃膜蛋白分為三類(lèi):Gr

14、oupⅠ～Ⅲ。GroupⅠ中的卵黃膜蛋白C末端存在一個(gè)保守的疏水性基序(35aa)，將其命名為VM結(jié)構(gòu)域。鱗翅目昆蟲(chóng)VM結(jié)構(gòu)域存在兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基(CX7C)，并且半胱氨酸殘基處存在非經(jīng)典氧化還原位點(diǎn)(CXXS、SXXC)。本研究首次證明VM結(jié)構(gòu)域在昆蟲(chóng)間的保守性，推測(cè)昆蟲(chóng)內(nèi)層卵殼結(jié)構(gòu)層在組裝形式上存在一致性，即通過(guò)分子間二硫鍵進(jìn)行交聯(lián)組裝。鱗翅目與雙翅目昆蟲(chóng)VM結(jié)構(gòu)域序列比對(duì)分析顯示，2號(hào)位半胱氨酸殘基高度保守，1號(hào)位半胱氨酸殘

15、基保守性次之，雙翅目昆蟲(chóng)VM結(jié)構(gòu)域中3號(hào)位半胱氨酸殘基在鱗翅目昆蟲(chóng)VM結(jié)構(gòu)域中不存在。推測(cè)昆蟲(chóng)VM結(jié)構(gòu)域正常功能行使依賴(lài)于基序的疏水性、CX7C殘基、及非經(jīng)典氧化還原位點(diǎn)，而對(duì)氨基酸殘基序列保守性要求不高。
　　 4、家蠶蠶卵致死突變體（l-em）突變機(jī)理研究
　　 家蠶l-em突變體為一份遵循偽母性遺傳的蠶卵卵殼突變致死隱性突變體，純合型雌雄個(gè)體（l-em/l-em）生活史正常，但雌個(gè)體(l-em/l-em)產(chǎn)下蠶卵將

16、在1h內(nèi)完全失水潰死。蠶卵表型特征暗示該突變體為內(nèi)層卵殼蛋白相關(guān)突變體，且突變與蠶卵卵殼的保水功能相關(guān)。
　　 為比較l-em/l-em和+/l-em個(gè)體間卵殼蛋白構(gòu)成差異，本研究獲取l-em/l-em個(gè)體和+/l-em個(gè)體成熟未受精卵，分離卵殼蛋白經(jīng)雙向電泳發(fā)現(xiàn)，l-em/l-em個(gè)體分離卵殼蛋白樣品中缺失一個(gè)～90kDa高豐度卵殼蛋白，參考Dazao卵殼蛋白雙向電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，缺失卵殼蛋白疑似為BmEP80。本研究使用BmEP

17、80抗體，經(jīng)Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)l-em突變體卵殼中缺失的高豐度卵殼蛋白為BmEP80。此外，l-em突變體卵巢組織中不表達(dá)BmEP80mRNA，表明BmEP80為l-em突變體的候選基因。
　　 本研究使用基因組PCRs、反向PCRs、基因組定量PCRs及Southernblot調(diào)查l-em突變體基因組中BmEP80位點(diǎn)結(jié)構(gòu)特征。檢測(cè)結(jié)果顯示l-em/l-em基因組中，BmEP80位點(diǎn)處～2kb序列被一個(gè)～96.3k

18、b的染色體大片段所替換，該～96.3kb染色體大片段包含三部分序列，依次為D-region1（～3.9kb，正方向重復(fù)）、iD-region2（～86.7kb，反方向重復(fù)）和一個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Qian(～5.7kb)。上述染色體片段重復(fù)事件涉及8個(gè)基因，依次為BmVMP23、BmEP80、Gene1、Gene2、Gene3、Gene4、Gene5和cJHBP。Gene1～5在此過(guò)程中完整的重復(fù)一次;cJHBP基因第五外顯子的部分序列被重復(fù)

19、一次;表達(dá)特征檢測(cè)結(jié)果顯示Gene1～5及cJHBP在+/l-em和l-em/l-em個(gè)體間表達(dá)差異不顯著，表明它們與l-em突變體的卵致死表型無(wú)關(guān)?；蚪M中基因拷貝數(shù)的增加會(huì)使得基因出現(xiàn)冗余，其中一個(gè)拷貝就會(huì)在后續(xù)的進(jìn)化過(guò)程中積累突變，進(jìn)而可能在基因組中產(chǎn)生具有新功能的基因。Gene1～5在l-em/l-em基因組中的完整重復(fù)一次，為新功能基因的進(jìn)化產(chǎn)生提供了序列基礎(chǔ)。
　　 BmVMP23和BmEP80預(yù)測(cè)為家蠶卵黃膜蛋白編

20、碼基因。l-em突變體基因組中，BmVMP23基因的3'端下游序列被D-region1所替換，造成BmVMP23mRNA聚腺苷化位點(diǎn)缺失。聚腺苷化位點(diǎn)缺失使得mRMA轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定性受影響，使得BmVMP23mRNA在l-em/l-em個(gè)體卵巢組織中僅微量存在。預(yù)測(cè)顯示BmVMP23不存在信號(hào)肽序列，為非分泌型蛋白，BmVMP23不會(huì)被分泌進(jìn)入胞外卵殼結(jié)構(gòu)，由此推測(cè)BmVMP23基因的破壞對(duì)胞外卵殼結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生影響，與l-em蠶卵突變表型無(wú)關(guān)

21、。BmEP80在l-em基因組中不完整重復(fù)一次，兩個(gè)拷貝均缺失5'端上游序列及ORF前160bp序列。BmEP80基因被破壞使得l-em/l-em個(gè)體卵巢組織中不表達(dá)該基因，相應(yīng)蠶卵卵殼中缺失BmEP80。結(jié)合BmEP80功能研究結(jié)果推測(cè)，BmEP80缺失使得家蠶卵殼結(jié)構(gòu)層中低電子密度均勻?qū)樱ǖ韧诠壖盁煵萏於曷褮さ南炠|(zhì)層，行使保水功能）形成受到影響，造成內(nèi)層卵殼結(jié)構(gòu)完整性及保水功能被破壞，導(dǎo)致蠶卵產(chǎn)后快速失水，形成l-em突變體蠶卵