家蠶內(nèi)層卵殼蛋白及蠶卵致死突變體(l-em)突變機(jī)理研究.pdf

1、卵子發(fā)生過程是昆蟲繁衍及種群維持的關(guān)鍵生理過程。昆蟲卵子發(fā)生將依次經(jīng)歷前卵黃生成期、卵黃生成期、卵殼生成期、及排卵和受精期等發(fā)育階段。
　　 昆蟲卵殼主要成分為蛋白質(zhì)，由卵巢組織中的特殊分泌型細(xì)胞-濾泡上皮細(xì)胞，于卵殼生成期分泌附著在卵細(xì)胞表面的一個(gè)復(fù)雜胞外結(jié)構(gòu)層。昆蟲卵殼包括外層卵殼層和內(nèi)層卵殼層（也稱為卵黃膜層）兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)層，行使保護(hù)胚胎免受機(jī)械損傷和微生物侵染、防止水分喪失、維持氣體交換、參與胚胎極性形成等重要功能。卵

2、殼結(jié)構(gòu)及其功能是昆蟲生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。
　　 昆蟲間卵殼蛋白的差異性，使得卵黃膜層結(jié)構(gòu)蛋白（也稱為卵黃膜蛋白）的研究長期局限于雙翅目昆蟲中，這種研究狀態(tài)與卵殼多樣性及生理功能重要性不相匹配。此外，昆蟲胞外卵殼結(jié)構(gòu)層的分泌組裝過程;不同昆蟲卵黃膜蛋白的構(gòu)成、序列特征、序列的保守性及差異性;卵黃膜蛋白編碼基因的表達(dá)特征、編碼基因在基因組中的分布特征等都是一系列未知的生物學(xué)問題。
　　 本研究以鱗翅目模式昆蟲-家蠶為研究對

3、象，構(gòu)建家蠶卵巢及蠶卵蛋白質(zhì)圖譜，通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，分析卵子發(fā)生過程中卵巢及蠶卵的蛋白質(zhì)組成及變化情況，鑒定獲取發(fā)育時(shí)期相關(guān)的特征蛋白質(zhì)。篩選家蠶及其它鱗翅目昆蟲卵黃膜蛋白及其編碼基因，比較分析不同昆蟲卵黃膜蛋白序列的保守性與差異性，并以家蠶卵黃膜蛋白-BmEP80為代表，結(jié)合相應(yīng)的蠶卵致死突變體(l-em)，對鱗翅目昆蟲卵黃膜蛋白進(jìn)行功能研究。主要獲得如下研究結(jié)果:
　　 1、家蠶蠶卯和卵巢組織蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　

4、 昆蟲卵子發(fā)生的基本功能單元為濾泡。在家蠶中，濾泡發(fā)育主要在蛹期完成，家蠶濾泡發(fā)育具有典型的次序性（也稱為不同步性），即卵巢管中依次排列著不同發(fā)育階段的濾泡，相鄰濾泡發(fā)育間隔2～2.5h。
　　 本研究獲取家蠶Dazao（野生型）化蛹7天卵巢組織、Dazao24h和48h受精卵、Dazao24h和48h非受精卵、滯育性Dazao受精卵、非滯育性Dazao受精卵、Dazao蠶卵卵殼、Dazao蠶卵內(nèi)容物、以及家蠶小卵突變種（em

5、i、sm、sm-2）化蛹7天卵巢組織，抽提蛋白質(zhì)，經(jīng)雙向電泳分析，獲取相應(yīng)的雙向電泳圖譜。選取Dazao化蛹7天卵巢組織及Dazao24h受精卵的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，挖取豐度較高的蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定分析，分別鑒定獲得33和42個(gè)不同的蛋白質(zhì)，構(gòu)建了家蠶蛹期卵巢組織及家蠶早期胚胎期蠶卵的蛋白質(zhì)圖譜。
　　 比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析Dazao24h和48h受精卵、及24h和48h非受精卵卵蛋白的雙向電泳圖譜，獲得與蠶卵

6、受精及早期胚胎發(fā)育相關(guān)的5個(gè)特征蛋白點(diǎn)，經(jīng)MALDI-TOF-MS鑒定發(fā)現(xiàn)，其中兩個(gè)特征蛋白質(zhì)為本研究在家蠶中首次鑒定獲得，分別命名為BmEP80和Peritrophin-like27。BmEP80合成于家蠶蛹期卵巢組織，之后存儲于蠶卵中，蠶卵受精后BmEP80將消失?；谏鲜鎏卣?，推測BmEP80為家蠶內(nèi)層卵殼結(jié)構(gòu)蛋白。Peritrophin-like27含有三個(gè)ChitinbindingPeritrophin-A結(jié)構(gòu)域，于蠶卵受精4

7、8h后出現(xiàn)。推測家蠶早期胚子形成過程中，Peritrophin-like27可能作為一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白參與某一組織或器官的形成。
　　 本研究通過比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，獲得滯育性受精卵與非滯育性受精卵卵蛋白的差異蛋白點(diǎn)，以及家蠶Dazao與家蠶小卵突變種卵巢組織蛋白質(zhì)的差異蛋白點(diǎn)。上述差異蛋白質(zhì)的鑒定與分析，對家蠶蠶卵滯育的形成以及家蠶小卵突變的研究提供了一些參考數(shù)據(jù)。
　　 2、家蠶BmEP80表達(dá)特征及功能研究
　　

8、 家蠶蠶卵比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，BmEP80疑似為家蠶內(nèi)層卵殼蛋白，基因組基因預(yù)測信息顯示BmEP80為單外顯子基因編碼的大分子量蛋白質(zhì)。本研究對BmEP80及其編碼基因的表達(dá)模式和功能開展相關(guān)分析。
　　 基因表達(dá)特征顯示:BmEP80特異表達(dá)于家蠶蛹中后期的卵巢組織;不同發(fā)育時(shí)期濾泡檢測結(jié)果顯示，BmEP80表達(dá)于卵黃生成期后期至卵殼生成期早期的濾泡中，高量表達(dá)區(qū)間為-5～+10;原位雜交結(jié)果顯示，BmEP80由濾泡上皮細(xì)

9、胞所表達(dá)，卵細(xì)胞不表達(dá)BmEP80。
　　 Westernblot檢測蛋白表達(dá)特征顯示，BmEP80開啟表達(dá)于～-10期濾泡;蠶卵不同組分蛋白質(zhì)雙向電泳分析顯示，蠶卵中的BmEP80分布于卵殼結(jié)構(gòu)中，而蠶卵內(nèi)容物無此蛋白;家蠶蠶卵卵殼免疫組化檢測結(jié)果顯示，BmEP80定位于一個(gè)狹窄的卵殼結(jié)構(gòu)層中，該結(jié)構(gòu)層位于小脊柱層和卵黃膜層之間。上述結(jié)果證實(shí)BmEP80為家蠶一個(gè)大分子量內(nèi)層卵殼蛋白編碼基因，BmEP80基因及蛋白的表達(dá)模式均

10、符合昆蟲內(nèi)層卵殼蛋白的特征。
　　 本研究使用RNA干涉方法研究家蠶BmEP80的功能，BmEP80siRNAs注射干涉后，蛹期卵巢組織中該基因表達(dá)受到瞬時(shí)抑制，相應(yīng)蠶卵卵殼中BmEP80蛋白含量下降約20％。BmEP80RNA干涉不影響濾泡后續(xù)發(fā)育過程，以及個(gè)體化蛾、交配產(chǎn)卵行為。卵殼中BmEP80降低使得蠶卵在胚胎發(fā)育過程中發(fā)生三角形凹陷，表明BmEP80作為家蠶內(nèi)層卵殼層的一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，行使維持卵殼結(jié)構(gòu)完整的功能，并且推測

11、與蠶卵卵殼保水功能相關(guān)。
　　 3、鱗翅目昆蟲卵黃膜蛋白編碼基因預(yù)測、表達(dá)特征及功能域分析
　　 昆蟲卵黃膜蛋白的研究局限于雙翅目昆蟲。雙翅目昆蟲之外，僅在家蠶中鑒定報(bào)道過一個(gè)卵黃膜蛋白-BmVMP30。序列比對分析顯示BmVMP30與雙翅目昆蟲卵黃膜蛋白不存在序列相似性。
　　 黑腹果蠅卵黃膜蛋白編碼基因（VM26Ab，VM26Ac和VM26Aa）成簇分布于2號染色體左臂26A位點(diǎn)處，基于對此特征的思考，本研究

12、在BmEP80側(cè)翼基因組序列上鑒定出3個(gè)預(yù)測卵黃膜蛋白編碼基因，表明家蠶基因組中也存在類似的卵黃膜蛋白編碼區(qū)。該區(qū)域中預(yù)測卵黃膜蛋白編碼基因依次命名為:BmVMP25(-)、BmVMP23(+)、BmEP80(+)、BmVMP30.1(+)?；虮磉_(dá)特征分析結(jié)果顯示，BmVMP25、BmVMP23及BmVMP30.1均表現(xiàn)為蛹期卵巢組織特異表達(dá)，并且表達(dá)于卵殼生成期早期之前的濾泡。預(yù)測基因的表達(dá)模式符合昆蟲卵黃膜蛋白編碼基因的表達(dá)特征。

13、
　　 煙草天蛾、帝王蝶、紅帶袖蝶基因組測序公布后，本研究進(jìn)行tBlastn檢索分析，發(fā)現(xiàn)已測序鱗翅目昆蟲基因組中均存在卵黃膜蛋白編碼區(qū)域，編碼區(qū)域內(nèi)分別鑒定到卵黃膜蛋白編碼基因4個(gè)、3個(gè)和4個(gè)，并且基因排列方式相一致，即第一個(gè)預(yù)測基因由負(fù)義鏈編碼，之后預(yù)測基因由正義鏈編碼。本研究揭示卵黃膜蛋白編碼基因成簇排布特征在鱗翅目昆蟲和雙翅目昆蟲間是保守的。
　　 基于序列差異性，本研究將已鑒定鱗翅目昆蟲卵黃膜蛋白分為三類:Gr

14、oupⅠ～Ⅲ。GroupⅠ中的卵黃膜蛋白C末端存在一個(gè)保守的疏水性基序(35aa)，將其命名為VM結(jié)構(gòu)域。鱗翅目昆蟲VM結(jié)構(gòu)域存在兩個(gè)保守的半胱氨酸殘基(CX7C)，并且半胱氨酸殘基處存在非經(jīng)典氧化還原位點(diǎn)(CXXS、SXXC)。本研究首次證明VM結(jié)構(gòu)域在昆蟲間的保守性，推測昆蟲內(nèi)層卵殼結(jié)構(gòu)層在組裝形式上存在一致性，即通過分子間二硫鍵進(jìn)行交聯(lián)組裝。鱗翅目與雙翅目昆蟲VM結(jié)構(gòu)域序列比對分析顯示，2號位半胱氨酸殘基高度保守，1號位半胱氨酸殘

15、基保守性次之，雙翅目昆蟲VM結(jié)構(gòu)域中3號位半胱氨酸殘基在鱗翅目昆蟲VM結(jié)構(gòu)域中不存在。推測昆蟲VM結(jié)構(gòu)域正常功能行使依賴于基序的疏水性、CX7C殘基、及非經(jīng)典氧化還原位點(diǎn)，而對氨基酸殘基序列保守性要求不高。
　　 4、家蠶蠶卵致死突變體（l-em）突變機(jī)理研究
　　 家蠶l-em突變體為一份遵循偽母性遺傳的蠶卵卵殼突變致死隱性突變體，純合型雌雄個(gè)體（l-em/l-em）生活史正常，但雌個(gè)體(l-em/l-em)產(chǎn)下蠶卵將

16、在1h內(nèi)完全失水潰死。蠶卵表型特征暗示該突變體為內(nèi)層卵殼蛋白相關(guān)突變體，且突變與蠶卵卵殼的保水功能相關(guān)。
　　 為比較l-em/l-em和+/l-em個(gè)體間卵殼蛋白構(gòu)成差異，本研究獲取l-em/l-em個(gè)體和+/l-em個(gè)體成熟未受精卵，分離卵殼蛋白經(jīng)雙向電泳發(fā)現(xiàn)，l-em/l-em個(gè)體分離卵殼蛋白樣品中缺失一個(gè)～90kDa高豐度卵殼蛋白，參考Dazao卵殼蛋白雙向電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，缺失卵殼蛋白疑似為BmEP80。本研究使用BmEP

17、80抗體，經(jīng)Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)l-em突變體卵殼中缺失的高豐度卵殼蛋白為BmEP80。此外，l-em突變體卵巢組織中不表達(dá)BmEP80mRNA，表明BmEP80為l-em突變體的候選基因。
　　 本研究使用基因組PCRs、反向PCRs、基因組定量PCRs及Southernblot調(diào)查l-em突變體基因組中BmEP80位點(diǎn)結(jié)構(gòu)特征。檢測結(jié)果顯示l-em/l-em基因組中，BmEP80位點(diǎn)處～2kb序列被一個(gè)～96.3k

18、b的染色體大片段所替換，該～96.3kb染色體大片段包含三部分序列，依次為D-region1（～3.9kb，正方向重復(fù)）、iD-region2（～86.7kb，反方向重復(fù)）和一個(gè)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Qian(～5.7kb)。上述染色體片段重復(fù)事件涉及8個(gè)基因，依次為BmVMP23、BmEP80、Gene1、Gene2、Gene3、Gene4、Gene5和cJHBP。Gene1～5在此過程中完整的重復(fù)一次;cJHBP基因第五外顯子的部分序列被重復(fù)

19、一次;表達(dá)特征檢測結(jié)果顯示Gene1～5及cJHBP在+/l-em和l-em/l-em個(gè)體間表達(dá)差異不顯著，表明它們與l-em突變體的卵致死表型無關(guān)。基因組中基因拷貝數(shù)的增加會使得基因出現(xiàn)冗余，其中一個(gè)拷貝就會在后續(xù)的進(jìn)化過程中積累突變，進(jìn)而可能在基因組中產(chǎn)生具有新功能的基因。Gene1～5在l-em/l-em基因組中的完整重復(fù)一次，為新功能基因的進(jìn)化產(chǎn)生提供了序列基礎(chǔ)。
　　 BmVMP23和BmEP80預(yù)測為家蠶卵黃膜蛋白編

20、碼基因。l-em突變體基因組中，BmVMP23基因的3'端下游序列被D-region1所替換，造成BmVMP23mRNA聚腺苷化位點(diǎn)缺失。聚腺苷化位點(diǎn)缺失使得mRMA轉(zhuǎn)錄或穩(wěn)定性受影響，使得BmVMP23mRNA在l-em/l-em個(gè)體卵巢組織中僅微量存在。預(yù)測顯示BmVMP23不存在信號肽序列，為非分泌型蛋白，BmVMP23不會被分泌進(jìn)入胞外卵殼結(jié)構(gòu)，由此推測BmVMP23基因的破壞對胞外卵殼結(jié)構(gòu)不產(chǎn)生影響，與l-em蠶卵突變表型無關(guān)

21、。BmEP80在l-em基因組中不完整重復(fù)一次，兩個(gè)拷貝均缺失5'端上游序列及ORF前160bp序列。BmEP80基因被破壞使得l-em/l-em個(gè)體卵巢組織中不表達(dá)該基因，相應(yīng)蠶卵卵殼中缺失BmEP80。結(jié)合BmEP80功能研究結(jié)果推測，BmEP80缺失使得家蠶卵殼結(jié)構(gòu)層中低電子密度均勻?qū)樱ǖ韧诠壖盁煵萏於曷褮さ南炠|(zhì)層，行使保水功能）形成受到影響，造成內(nèi)層卵殼結(jié)構(gòu)完整性及保水功能被破壞，導(dǎo)致蠶卵產(chǎn)后快速失水，形成l-em突變體蠶卵