家蠶i-lem突變體的轉(zhuǎn)錄組分析與基因定位克隆.pdf

1、昆蟲復(fù)雜多樣化的色彩模式一直是生態(tài)學(xué)進(jìn)化研究的興趣點(diǎn)所在，因?yàn)樗鼈兊某霈F(xiàn)與自然選擇息息相關(guān)。在鱗翅目昆蟲中，家蠶（Bombyx mori）是最適合識別鑒定負(fù)責(zé)顏色模式基因的模式生物，因?yàn)榧倚Q既存在許多體色突變體，又有基因組序列和高密度連鎖圖。家蠶體色突變體是研究昆蟲體色形成機(jī)制的寶貴生物資源。本文以家蠶黃體色抑制突變體i-lem為研究對象，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)比較i-lem與黃體色突變體lem在轉(zhuǎn)錄水平上功能基因和生理代謝通路的差異，通過

2、定位克隆技術(shù)篩選 i-lem突變體的候選基因，以期對家蠶 i-lem突變發(fā)生的分子機(jī)制及其對色素合成調(diào)控相關(guān)的功能進(jìn)行探究。主要結(jié)果如下：
　　一、轉(zhuǎn)錄組測序方面
　　1.成功構(gòu)建了i-lem和lem兩個(gè)轉(zhuǎn)錄組測序文庫，Clean reads占Raw reads的比例為98.7％，Q30均高于96.2%，Total Mapped Reads占Clean reads在85.5%左右，其中Uniquely Mapped Read

3、s占Clean reads82.0%左右，Error rate和GC content都控制在合理的范圍之內(nèi)，說明文庫的質(zhì)量合格。
　　2.2個(gè)文庫間共發(fā)現(xiàn)86個(gè)差異表達(dá)基因，其中35個(gè)上調(diào)表達(dá)、51個(gè)下調(diào)表達(dá)。對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析和KEGG分析，分別富集到58個(gè)GO term和14條顯著性Pathway，所涉及基因的上下調(diào)表達(dá)可能影響蠶體內(nèi)多個(gè)生理代謝途徑。
　　3. GO分析和KEGG代謝途徑中的差異表達(dá)基因主要分為

4、兩大類：表皮蛋白編碼基因和參與昆蟲先天性免疫應(yīng)答系統(tǒng)的基因。28個(gè)表皮蛋白編碼基因和PAH、Serpin-4等9個(gè)昆蟲先天性免疫應(yīng)答系統(tǒng)相關(guān)基因以及他們參與的代謝通路，是i-lem突變體與lem突變體之間的主要差異。
　　二、i-lem定位克隆方面
　　1.以ah09(+i-lem/+i-lem;lem/lem)和l82(i-lem/i-lem;lem/lem)作為親本，配制回交BC1M代群體，共收集358頭用于i-lem的

5、定位克隆研究。利用四眠期幼蟲體色差異鑒別出159頭i-lem突變型(淺黃)個(gè)體和199頭lem突變型(深黃)個(gè)體。利用11個(gè)可用分子標(biāo)記在定位克隆群體中成功構(gòu)建了i-lem連鎖圖譜，該圖譜包含72個(gè)交換個(gè)體，i-lem基因鎖定區(qū)域的物理距離約為170 kb，包含11個(gè)預(yù)測基因。
　　2.利用GO注釋、Smart網(wǎng)站、家蠶基因芯片數(shù)據(jù)信息以及RT-PCR分析結(jié)果表明，預(yù)測基因BMgn009799編碼的蛋白屬于醛酮還原酶（AKR）家族

6、，該基因在i-lem突變體與野生型之間擴(kuò)增出不同長度的轉(zhuǎn)錄本。在+i-lem/+i-lem中轉(zhuǎn)錄出含7個(gè)外顯子的ORF，長度為1026 bp，編碼341 aa；而i-lem/i-lem中僅轉(zhuǎn)錄出長為270 bp的ORF，只包含第1和第7兩個(gè)外顯子，編碼89 aa的縮短型多肽，即BMgn009799在i-lem突變體缺失了外顯子2-6。
　　3.根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)墨蝶呤還原酶（SPR）發(fā)生功能障礙時(shí)，醛酮還原酶（AKR）或羰基還原酶（

7、CR）可以替代SPR參與四氫生物蝶呤（BH4）等蝶呤類色素的合成代謝途徑，而lem的突變表型（墨蝶呤大量沉積于體表）正是由于BmSPR的功能不足所致。因此，我們推測BMgn009799編碼的AKR家族成員很可能參與i-lem蠶體內(nèi)的蝶呤類色素合成代謝途徑。
　　綜上，我們將定位區(qū)域內(nèi)的預(yù)測基因BMgn009799鎖定為i-lem突變候選基因。i-lem突變蠶(i-lem/i-lem;lem/lem)通過編碼活性更高的AKR在BH4