番茄植株螺旋生長突變體hel遺傳分析與基因克隆.pdf

1、番茄是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物。植株的螺旋生長往往對植株的生長發(fā)育產(chǎn)生重要的影響。在擬南芥中很多螺旋生長相關(guān)的分子機(jī)制已經(jīng)研究清楚，但是對于番茄螺旋生長的調(diào)控途徑還沒有相關(guān)的報道。對番茄植株螺旋生長的研究不僅具有重要的理論意義，而且了解突變體螺旋生長的突變機(jī)制可以為進(jìn)一步了解茄科物種的生長習(xí)性奠定了良好的基礎(chǔ)。螺旋突變體的hel還可以為進(jìn)一步深入研究番茄微管功能多樣性以及激素控制植株株型的研究提供珍貴的實(shí)驗(yàn)材料。
　　本研究以hel突變

2、體為研究對象，通過對突變體進(jìn)行表型鑒定，遺傳分析，同時和野生型材料LA1589雜交構(gòu)建F2代分離群體，開發(fā)分子標(biāo)記克隆目的基因，探究突變體的突變機(jī)制。為進(jìn)一步深入研究番茄微管功能多樣以及激素控制植株株型的研究提供一定的理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1、hel突變體表型穩(wěn)定，其幼苗期子葉和葉柄較正常植株均出現(xiàn)了右手螺旋生長。對突變體整個生育期進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)其莖也出現(xiàn)了右手螺旋的彎曲，該突變表型持續(xù)整個生育期。
　　2、對he

3、l突變體幼苗子葉的主葉脈與葉柄之間的夾角測量發(fā)現(xiàn)突變體hel兩片子葉的螺旋角度平均值分別約為39.8°和40.1°，這表明突變體子葉的螺旋生長是左右對稱的。
　　3、取螺旋生長的突變體的葉柄做石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)葉柄螺旋生長部位的表皮細(xì)胞排列不均勻，并且出現(xiàn)了弧形排列。
　　4、以hel突變體為父本，野生型材料LA1589為母本進(jìn)行雜交，構(gòu)建F2遺傳分離群體。遺傳分析表明hel螺旋生長的突變表型是由隱性基因控制。
　　5、

4、通過BSR-Seq的方法進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)四號染色體上出現(xiàn)了明顯的SNP位點(diǎn)，這表明目的基因在四號染色體上面。
　　6、利用番茄基因組數(shù)據(jù)在四號染色體上開發(fā)三種標(biāo)記用于目的基因定位。包括InDel、SNP、CAPS標(biāo)記。首先用8對具有穩(wěn)定多態(tài)性的InDel標(biāo)記對從hel×LA1589的F2遺傳群體中分離出的具有子葉以及莖螺旋生長表型的108棵單株進(jìn)行遺傳連鎖分析，將hel基因定位于兩個標(biāo)記CH4-25和CH4-35之間，遺傳距離約為

5、2.4cM;進(jìn)一步擴(kuò)大F2代作圖群體，開發(fā)新的SNP、CAPS標(biāo)記，進(jìn)一步用從F2代群體中分離的具有突變體表型的1136棵單株用于遺傳連鎖分析，最終把目的基因hel精確定位于標(biāo)記SNP4-6和SNP4-2之間約389kb的物理區(qū)間內(nèi)。
　　7、利用基因分析與預(yù)測網(wǎng)站，在標(biāo)記SNP4-6和SNP4-2之間預(yù)測到20個開放閱讀框(ORFs)。通過對部分開放閱讀框(ORFs)在CR291和hel突變體中的表達(dá)量分析表明ORF2在突變體h

6、el中的表達(dá)量顯著低于其背景材料CR291中的表達(dá)量。進(jìn)一步開發(fā)覆蓋候選基因ORF2編碼區(qū)全長的特異性引物，以hel突變體以及其背景材料CR291為模板測擴(kuò)增和測序，通過基因序列的比對我們發(fā)現(xiàn)ORF2核苷酸序列在hel突變體以及其背景材料CR291有18個氨基酸的變化。我們進(jìn)一步預(yù)測其氨基酸序列，結(jié)果顯示hel突變體氨基酸序列較CR291發(fā)生了大片段的缺失。
　　8、通過液相色譜法測定hel突變體以及其背景材料CR291生長素含量

7、，結(jié)果顯示hel突變體中生長素的含量大約只有對照CR291的三分之一，即與其背景材料CR291相比，螺旋生長突變體hel生長素的含量顯著降低。
　　9、通過BSR-seq數(shù)據(jù)分析hel突變體以及CR291中生長素生物合成以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵基因表達(dá)變化。其中生長素生物合成途徑中的P450和ISS1在hel突變體中的表達(dá)量顯著高于對照材料CR291。AMI1的表達(dá)量在hel突變體中的表達(dá)量顯著低于對照材料CR291。在生長素信號轉(zhuǎn)