簡化的人纖溶酶原餅環(huán)區(qū)5基因的克隆及表達與初步鑒定.pdf

1、背景與目的：血管發(fā)生存在于許多病理演變過程中，如增殖性視網膜病變、心血管?。▌用}粥樣硬化）、以及腫瘤的生長、浸潤和轉移等環(huán)節(jié)。血管發(fā)生是一個復雜的、由激活因子與抑制因子共同調控的過程。目前，在所報道的內源性抑制因子中，血管抑素是最強的血管發(fā)生的負向調節(jié)因子之一，它是人纖溶酶原的內源片段，由纖溶酶原的五個Kringle環(huán)中的前四個構成，在體內外的腫瘤模型試驗均已證實了血管抑素能夠有效的抑制腫瘤生長。最近研究發(fā)現(xiàn)，與血管抑素由一個賴氨酸相連

2、的人纖溶酶原的第五個Kringle環(huán)，即人纖溶酶原Kringle5（Human plasminogenkringle 5，hPK-5），它的抗內皮細胞遷移能力更強，能夠更有效的抑制由生長因子誘導的新生血管增殖，并能誘導部分腫瘤細胞凋亡。分子遺傳學研究表明，人纖溶酶原內部的這5個Kringle環(huán)的蛋白質一級結構有50％左右的同源性。然而它們表現(xiàn)的生物學活性各不相同。完整的Kringlel-3區(qū)有較強的抑制血管內皮細胞增殖活性，Kringl

3、e4的抑制內皮細胞增殖作用較弱，而Kringle5區(qū)抑制內皮細胞增殖和抗遷移能力都較強。這使得Kringle5的應用價值更為突出。目前，hPK-5主要是通過基因工程重組技術獲得，其純化復雜，且得率較低，而且hPK-5的相對分子量仍偏大。因此，我們通過研究hPK-5的功能性區(qū)域及蛋白的空間結構，刪除了hPK-5的核苷酸序列的N端和C端各部分殘基，保留了環(huán)狀結構上的全部氨基酸，直接克隆出了簡化后的hPK-5（predigested hPK-

4、5,predhPK-5），并將其與GST進行融和表達。 方法：從肝癌患者術后的癌旁組織中提取總RNA，經過合理設計引物，利用RT-PCR直接得到簡化的hPK-5基因。將該基因克隆至原核表達質粒pGEX-1λT，再將此重組載體轉化大腸桿菌JM109，經PCR檢測、酶切鑒定及測序鑒定陽性克隆。用IPTG誘導陽性克隆表達融合蛋白，SDS-PAGE觀察表達產物。再通過用特異性抗體做Western-Blotting進一步鑒定融合表達蛋白。

5、 結果：簡化的hPK-5基因的RT-PCR產物為264bp。通過PCR、酶切、測序等方法鑒定簡化的hPK-5基因正確克隆至原核表達質粒pGEX-1λT中。重組質粒pGEX-1λT/predhPK-5在大腸桿菌JM109中成功地表達出了GST/predhPK-5融合蛋白，并通過免疫學測定，相對分子質量約為3.6×10<'4>，與理論值3.58×10<'4>相符。目的蛋白表達量占菌體總蛋白的23.6％。結論成功克隆出來簡化的hPK-