中國蛇島蝮蛇毒腺部分ESTs表征及纖溶酶原激活物的克隆與表達.pdf

1、蛇毒是含有多種生物活性蛋白和多肽的混合物，具有廣泛的生物學活性。采用捕蛇或養(yǎng)蛇的方法獲得蛇毒進而分離純化蛇毒蛋白存在得量少、純度低的局限性，因而利用基因工程方法生產(chǎn)高純度蛇毒蛋白迫在眉睫。蛇毒中的纖溶酶原激活物是具有獨特活性的絲氨酸蛋白酶，可專一性地將纖溶酶原變成纖溶酶，溶解纖維蛋白，達到溶解血栓的目的。并且具有半衰期長、選擇性強等優(yōu)點，有較強的開發(fā)潛力。
　　 目的:
　　 1.對中國大連蛇島蝮蛇(Gloydiussh

2、edaoensisshedaoensis，GSS)毒腺(GSSG)的cDNA文庫(GSSG-cDNA)進行表達序列標簽(ESTs)測定，獲得GSSGESTs序列;2.利用基因工程的方法對GSSG中的纖溶酶原激活物(Plasminogenactivator，PA)進行基因克隆和蛋白表達。
　　 方法和結(jié)果:
　　 1.從本實驗室構(gòu)建的GSSG-cDNA文庫陽性重組子中隨機挑選216個單克隆進行5'端EST單向測序。獲得了2

3、11條高質(zhì)量的ESTs，NCBInr數(shù)據(jù)庫BlastX比對分析表明，84條序列為已知功能基因，29條序列為未知功能基因，98條序列為新基因;2.以GSSG-cDNA文庫質(zhì)粒為模板，根據(jù)GSSG-PA的肽段序列TLCAGTQQGG設(shè)計一段中間引物，以文庫質(zhì)粒載體pDNR-LIB對應(yīng)的M13引物作為上下游引物，PCR反應(yīng)擴增得到GSSG-PA基因;3.對GSSG-PA基因11個密碼子定點突變成大腸桿菌的優(yōu)選密碼子，得到GSSG-PA'基因。

4、構(gòu)建了pGEX-6P-1-GSSG-PA'表達載體，并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達，結(jié)果顯示GSSG-PA蛋白以包涵體形式存在;4.構(gòu)建了pPIC9K-GSSG-PA表達載體，電轉(zhuǎn)化到真核體系即畢赤酵母菌株GS115中進行表達，菌落PCR證實目的基因成功整合在酵母染色體上;5.構(gòu)建pColdI-GSSG-PA'表達載體，在誘導(dǎo)GSSG-PA蛋白表達時發(fā)現(xiàn)了其明顯的抑菌作用。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功獲得GSSG的部分