組織型纖溶酶原激活物DNA改組的探索研究.pdf

1、tPA(tissue-typeplasminogenactivator)是活性和特異性最強(qiáng)的一種溶栓藥物，但在體內(nèi)短暫的半衰期很大程度上阻礙著該藥發(fā)揮應(yīng)有的作用。本文設(shè)想更高活性的tPA能在一定程度上緩解這一矛盾。 DNA改組(DNAshuffling)技術(shù)的問(wèn)世為人們獲得更高活性的基因表達(dá)產(chǎn)物提供了一個(gè)全新的技術(shù)平臺(tái)。然而，迄今為止DNA改組仍只限于對(duì)原核表達(dá)產(chǎn)物有活性的一組基因的改組，對(duì)那些只有真核表達(dá)才有活性的基因的改組，

2、由于篩選中存在的一系列困難而受阻。所以真核表達(dá)改組是人們努力的一個(gè)方向。本研究對(duì)這一技術(shù)在tPA分子定向進(jìn)化中應(yīng)用的可能性進(jìn)行了探討，期望這一探索性結(jié)果能夠?yàn)楹罄m(xù)幾輪的tPADNA改組探明道路，為最終從改組后tPA多樣性基因庫(kù)中篩選到比較理想的重組體打下基礎(chǔ)，也為其它需要以真核表達(dá)為基礎(chǔ)的DNA改組提供可借鑒的經(jīng)驗(yàn)。 首先采用RT-PCR方法獲得一組哺乳類動(dòng)物tPA的cDNA基因，包括大白鼠、恒河猴、人的tPAcDNA。將這些基

3、因分別進(jìn)行克隆、測(cè)序、原核與真核表達(dá)。測(cè)序結(jié)果表明恒河猴tPAcDNA編碼區(qū)(含信號(hào)肽)與發(fā)表的人tPAcDNA編碼區(qū)的核苷酸序列同源性為96％，由此所推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為97.5％。大白鼠tPAcDNA編碼區(qū)(含信號(hào)肽)與文獻(xiàn)發(fā)表的大白鼠tPAcDNA編碼區(qū)的核苷酸序列，除2個(gè)堿基不同外，其余完全相同，與發(fā)表的人tPAcDNA編碼區(qū)的核苷酸序列同源性約為80％(不含信號(hào)肽)，由此所推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為83％。本實(shí)驗(yàn)所用的人

4、tPAcDNA由本室提供，是經(jīng)基因突變改造過(guò)的第二代人tPA基因。將恒河猴、大白鼠、人tPAcDNA克隆于真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后表達(dá)出了有活性的tPA。培養(yǎng)上清檢測(cè)結(jié)果顯示人tPA在CHO細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的活性最高，恒河猴和大白鼠tPA的活性明顯低于人tPA的活性。將這三種tPA基因分別克隆于原核表達(dá)載體，結(jié)果表明原核表達(dá)產(chǎn)物幾乎沒(méi)有活性。 一個(gè)合適的表達(dá)篩選系統(tǒng)是DNA改組成功的關(guān)鍵。由于tPA只能在真核細(xì)胞中表達(dá)才有活

5、性，所以DNA改組后的篩選只能建立在真核表達(dá)的基礎(chǔ)上，這就意味著需要完成大量的探索性工作。本研究探索了DNA改組后的篩選途徑，建立了大規(guī)模tPA活性篩選檢測(cè)的方法。1.篩選途徑：就是建立在真核表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)單個(gè)細(xì)胞的克隆分離，實(shí)現(xiàn)篩選的第一步。真核表達(dá)中單個(gè)細(xì)胞克隆的獲得比原核表達(dá)中單菌落的獲得其難度和工作量要大得多。我們采用了稀釋細(xì)胞，96孔板克隆的方法，從中摸索出了一些可行的經(jīng)驗(yàn)和方法。2.篩選檢測(cè)方法：大規(guī)模篩選的檢測(cè)方

6、法也是DNA改組的關(guān)鍵。DNA改組后的篩選檢測(cè)方法不同于其他一些表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)可用簡(jiǎn)便的免疫學(xué)檢測(cè)方法，改組后的篩選必須要檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性，而且是大規(guī)模的檢測(cè)。傳統(tǒng)的tPA活性檢測(cè)方法是瓊脂平板法。該方法一次只能做幾份至幾十份的樣品，無(wú)法適用于改組后一次完成幾千至幾萬(wàn)份樣品的檢測(cè)。我們將此方法進(jìn)行了改良，建立了適用于tPADNA改組后大樣品量檢測(cè)的篩選方法。 在上述的基礎(chǔ)工作準(zhǔn)備完成后，我們以人tPAcDNA、恒河猴及大

7、白鼠tPAcDNA為一組基因進(jìn)行了tPA的改組(DNAfamilyshuffling)和篩選。篩選的結(jié)果和原先的設(shè)想有較大的距離，經(jīng)過(guò)近20批次的改組和篩選，我們沒(méi)有篩選到活性明顯高于人tPA(經(jīng)TNK優(yōu)化改構(gòu)過(guò))的克隆。我們只得到了兩株活性略高于人tPA的克隆，經(jīng)RT-PCR、克隆、測(cè)序，證明為改組后的基因。再次轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞、96孔板克隆，挑選表達(dá)量最高的克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后收獲上清、測(cè)其含量。與同樣獲得的人tPA表達(dá)上清比較它們之間的

8、活性。結(jié)果顯示兩株克隆的活性分別高于人的4倍和2倍。這一結(jié)果和其他一些蛋白活性物質(zhì)改組后活性提高幾千至幾萬(wàn)倍相距甚遠(yuǎn)，也未達(dá)到我們?cè)O(shè)想的提高幾十至幾百的目標(biāo)。雖然這是一項(xiàng)探索性的工作，而且只是第一輪改組的結(jié)果，但是最終獲得這一篩選結(jié)果仍不能令人滿意。導(dǎo)致這一結(jié)果的原因可能是：1.tPA的結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，有多個(gè)二硫鍵，改組后易影響tPA的折疊，引起活性的降低。2.改組后基于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的篩選相對(duì)原核表達(dá)系統(tǒng)的篩選而言效率太低，其中包括真

9、核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和一次篩選的克隆數(shù)都遠(yuǎn)不及原核。3.一個(gè)真核細(xì)胞可同時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)幾種不同的基因，而且一個(gè)基因表達(dá)量的高低又與其整合的位置有關(guān)，所以給篩選工作帶來(lái)了較大的困難，無(wú)法有效地從多樣性基因庫(kù)中篩選到高活性的基因。 篩選到的這兩株克隆序列測(cè)定結(jié)果表明，它們的序列以人和猴tPA的序列為主。和人tPA氨基酸序列(TNK)比較，其中一株克隆有16個(gè)氨基酸的差別，另一株有15個(gè)氨基酸的差別，有趣的是這一克隆有一88個(gè)氨基酸片段的缺失。

10、在這些變異中，多數(shù)的變異序列來(lái)源于恒河猴，個(gè)別變異來(lái)源于大白鼠tPA。同樣和恒河猴tPA氨基酸序列相比，多數(shù)的變異序列來(lái)源于人，個(gè)別變異來(lái)源于大白鼠tPA。 此外，本研究還嘗試了對(duì)人tPA進(jìn)行進(jìn)一步的改造。在原有第117位Asn突變成Gln的基礎(chǔ)上又將人tPA的第184，448的Asn突變成Gln，構(gòu)建了含117、184二個(gè)突變點(diǎn)和含117、184、448三個(gè)突變點(diǎn)的兩種突變體。文獻(xiàn)報(bào)道此改造能提高tPA的活性，我們得到的結(jié)果表

11、明這二個(gè)糖基化位點(diǎn)和三個(gè)糖基化位點(diǎn)的同時(shí)消除并不影響tPA的活性，但是也未觀察到活性有所提高。針對(duì)tPA在體內(nèi)的半衰期短這一問(wèn)題，又將人IgG1Fc段基因與人tPA基因相連接，在CHO細(xì)胞中表達(dá)融合型的tPA，期望融合型的tPA能夠延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期。但是結(jié)果顯示，融合人Fc段的tPA其活性基本喪失。 一組基因經(jīng)過(guò)第一輪DNA改組后不一定就能獲得活性非常高的克隆，往往要以前一輪改組后獲得的活性略高的幾個(gè)克隆為基礎(chǔ)進(jìn)行下一輪的改