組織型纖溶酶原激活物(tPA)和尿激酶型纖溶酶原激活物(uPA)在小鼠肝纖維化中的作用.pdf

1、肝纖維化是多種慢性肝臟疾病的重要病理歷程，近年來認(rèn)為是損傷后的修復(fù)反應(yīng)，主要是由于肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)代謝失衡，導(dǎo)致ECM在肝臟中過渡沉積所致。ECM包括膠原、非膠原糖蛋白、蛋白多糖及彈性硬蛋白，其中膠原蛋白是ECM最重要的組成部分。
　　 纖溶酶原激活劑包括組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogenactivator，tPA)和尿激酶纖溶酶原激活劑(urokinas

2、e plasminogen activator，uPA)，兩者同屬于絲氨酸蛋白酶家族，均可激活纖溶酶原(plasminogen，Plg)轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶(plasmin)。tPA的主要功能是激活Plg成為plasmin，后者能夠降解血栓中的水不溶纖維蛋白，形成水溶性降解片斷，使血栓溶解，血管再通，所以tPA用于治療急性心肌梗塞等血栓疾病。uPA和它的受體uPAR(urokinaseplasminogen activator receptor

3、)與腫瘤細(xì)胞的侵襲，轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。纖溶酶除了直接降解纖維蛋白以外，還能激活基質(zhì)金屬蛋白酶家族的成員(matrixmetalloproteinases，MMPs)，后者是ECM中主要的蛋白質(zhì)水解酶，因此，我們認(rèn)為纖溶酶激活劑可能在肝纖維化中發(fā)揮一定的作用。
　　 為了研究tPA在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用，我們利用了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物-tPA基因敲除小鼠。我們首先用野生型和tPA基因敲除小鼠通過一定劑量和濃度的四氯化碳腹腔注射，每周兩次

4、，連續(xù)注射4周，建立小鼠肝纖維化模型，腹腔注射等量橄欖油的野生型和tPA基因敲除小鼠作為相應(yīng)的對(duì)照。4周后，小鼠被處死，用酶譜學(xué)的方法研究tPA在各組小鼠肝臟組織中的活性，結(jié)果顯示，tPA活性在四氯化碳腹腔注射野生型小鼠肝臟組織中大量增高，而tPA基因敲除小鼠肝組織中沒有檢出tPA活性。tPA活性在四氯化碳誘導(dǎo)后的增高提示tPA與肝纖維化有密切的關(guān)系。
　　 蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin and Eosin，HE)顯

5、示，tPA基因缺失小鼠在造模后的肝組織損傷以及疤痕形成程度比野生型小鼠明顯加重，并且有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。組織化學(xué)研究VG(Van Gieson)染色和羥脯氨酸含量的檢測(cè)均顯示了膠原蛋白在tPA基因敲除小鼠肝臟組織中有大量的沉積，以上結(jié)果說明tPA基因敲除小鼠肝纖維化比野生型小鼠明顯加重。
　　 肝纖維化是ECM在肝臟中大量沉積導(dǎo)致的，為了進(jìn)一步的研究tPA基因缺失加重肝纖維化的分子機(jī)制，我們研究了tPA基因敲除小鼠和野生型小鼠

6、肝臟組織中ECM生成和降解兩方面的差異。a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-smooth muscle actin，a-SMA)是肝星型細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts，MFs)轉(zhuǎn)化的主要分子標(biāo)志，后者是生成ECM的主要細(xì)胞。MMPs是ECM降解的主要酶類，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)是其重要的抑制劑。我們分別研究了a-SMA，基質(zhì)金屬蛋白酶

7、-13(matrixmetalloproteinase-13，MMP-13)，TIMP-1的蛋白表達(dá)水平和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrixmetalloproteinase-9，MMP-9)的活性變化，結(jié)果顯示tPA基因敲除小鼠肝臟組織a-SMA的表達(dá)增高，MMP-2和MMP-9的活性下降，同時(shí)MMP-13的表達(dá)下降，TIMP-1的表達(dá)增高，以上的結(jié)

8、果說明tPA基因缺失加劇肝纖維化的程度是通過：1.增加肝星型細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化使ECM大量產(chǎn)生以；2.MMPs和TIMP-1的比例失調(diào)使ECM的降解減少。
　　 以病毒為載體，外源轉(zhuǎn)入uPA基因可以減輕大鼠肝硬化，顯示肝纖維化過程中uPA有重要的作用。為了研究uPA基因在肝纖維化中的作用，我們使用uPA基因缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠建立肝纖維化模型。比較各組小鼠肝臟實(shí)體和病理組織學(xué)等變化，結(jié)果顯示，四氯化碳處理后的uPA

9、基因缺失小鼠相對(duì)于野生型小鼠肝臟實(shí)體發(fā)白，表面不光滑，質(zhì)地明顯變硬。HE染色顯示四氯化碳處理后的肝組織損傷程度比野生型小鼠明顯加重，肝細(xì)胞出現(xiàn)大量的空泡樣改變。VG染色和羥脯氨酸含量的檢測(cè)說明膠原蛋白在uPA基因缺失小鼠肝臟中的含量明顯增高。作為肝纖維化ECM的主要成分，Ⅰ型膠原蛋白的實(shí)時(shí)定量PCR分析說明四氯化碳處理后，uPA基因缺失小鼠Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)明顯較野生型小鼠增高。uPA基因缺失小鼠肝臟組織中a-SMA mRNA和及其編碼蛋