纖溶酶原激活物抑制劑-1 siRNA治療實(shí)驗(yàn)性肝纖維化.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 肝纖維化(hepatic fibrosis)的特征性病理改變是肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)的過(guò)多沉積。減少ECM沉積、促進(jìn)ECM降解是治療肝纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。由尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase-type plasminogen activator，uPA)、纖溶酶(plasmin)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inh

2、ibitor-1，PAI-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)構(gòu)成的反應(yīng)體系是調(diào)節(jié)ECM降解的主要途徑之一，在肝纖維化形成和發(fā)展中起重要作用。uPA位于纖維化調(diào)控的上游，可激活纖溶酶原形成纖溶酶，后者可進(jìn)一步活化MMPs；纖溶酶和活化的MMPs均可降解膠原、蛋白多糖等ECM成分。PAI-1可與uPA結(jié)合，抑制uPA對(duì)纖溶酶原的激活作用，從而促進(jìn)ECM沉積和肝纖維化發(fā)展。
　　 正常

3、生理情況下，體內(nèi)uPA和PAI-1表達(dá)處于平衡狀態(tài)，而在肝纖維化發(fā)生過(guò)程中，uPA活性逐漸降低，PAI-1表達(dá)則不斷增高，過(guò)多表達(dá)的PAI-1通過(guò)與uPA結(jié)合抑制其纖溶激活作用，進(jìn)而導(dǎo)致uPA，纖溶酶和MMPs系統(tǒng)活性下調(diào)，ECM沉積明顯增加，加重肝纖維化程度。本科室前期研究表明，在肝纖維化過(guò)程中上調(diào)uPA表達(dá)可以改善肝纖維化進(jìn)程；此外，近期多項(xiàng)研究結(jié)果還顯示，PAI-1基因敲除小鼠對(duì)纖維化形成具有保護(hù)作用，而PAI-1過(guò)表達(dá)小鼠可加重

4、纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，我們?cè)O(shè)想通過(guò)下調(diào)肝纖維化過(guò)程中PAI-1的表達(dá)可能達(dá)到治療肝纖維化的目的。
　　 小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)技術(shù)是以轉(zhuǎn)錄后調(diào)控為目的的新型基因調(diào)控與治療技術(shù)。通過(guò)合成反義小分子RNA特異性抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。RNA干擾(RNA interfering，RNAi)具有操作簡(jiǎn)單，可調(diào)控性和靶向性強(qiáng)、高效抑制靶基因表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。
　　 本研究以肝纖維化過(guò)程中

5、上調(diào)的PAI-1基因作為靶點(diǎn)，利用siRNA技術(shù)，通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究PAI-1 siRNA對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的治療效果，為抗肝纖維化治療提供新的靶點(diǎn)和途徑。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]
　　 一、篩選PAI-1 siRNA
　　 應(yīng)用RNAi設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)并合成針對(duì)PAI-1 mRNA219、559、1061和2665位點(diǎn)的4對(duì)21核苷酸(nt)siRNA，分別轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate ce

6、ll，HSC)株HSC-T6。以轉(zhuǎn)染非特異siRNA(NC siRNA，與PAI-1 mRNA無(wú)同源性的21 ntsiRNA)作為陰性對(duì)照，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR(real-time reverse transcriptionpolymerase chain reaction，real time RT-pCR)和Western blot方法檢測(cè)四對(duì)siRNA分子對(duì)PAI-1基因及蛋白水平的阻抑效率，篩選出針對(duì)PAI-1 mRNA高效的

7、siRNA片段。
　　 二、PAI-1 siRNA對(duì)HSC-T6生物學(xué)特性的影響
　　 通過(guò)細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)染以及構(gòu)建穩(wěn)定株兩種方法將篩選出的PAI-1 siRNA轉(zhuǎn)染至HSC-T6內(nèi)，應(yīng)用real time RT-PCR法檢測(cè)肝纖維化基因mRNA表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測(cè)定HSC-T6上清Ⅰ、Ⅲ型膠原含量；四甲基偶氮唑鹽(methyl thiazo

8、lyl tetrazolium，MTT)法測(cè)定細(xì)胞增殖變化；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析細(xì)胞周期等生物學(xué)特性的影響。
　　 三、針對(duì)PAI-1 siRNA的腺病毒載-AdshPAI的構(gòu)建以及鑒定
　　 合成針對(duì)219位點(diǎn)的PAI shRNA片段，利用pSuper載體的H1啟動(dòng)子，體外連接構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒pAdshPAI，經(jīng)293細(xì)胞包裝后得到復(fù)制缺陷型重組腺病毒AdshPAI，同法構(gòu)建對(duì)照病毒AdNC(與PAI-1 mRNA無(wú)同

9、源性的NC shRNA)和表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)病毒AdGFP。將AdshPAI和AdNC分別體外感染HSC-T6，以RT-PCR法檢測(cè)AdshPAI對(duì)PAI-1的抑制效果。
　　 四、AdshPAI體內(nèi)導(dǎo)入對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的治療作用
　　 分別構(gòu)建膽總管結(jié)扎(bile duct ligation，BDL)和二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine，DM

10、N)兩種大鼠肝纖維化模型。在BDL模型中，將雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。分設(shè)假手術(shù)組、模型對(duì)照組、病毒AdNC對(duì)照組和AdshPAI導(dǎo)入組。鈍性分離并結(jié)扎膽總管，制備BDL肝纖維化模型。于術(shù)前48 h AdNC組和AdshPAI組分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入4×109pfu/只AdNC或AdshPAI。于手術(shù)后第21 d處死大鼠。在DMN模型中，將雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。第1組為正常對(duì)照組：第2～4組為肝纖維化模型組，予1％D

11、MN以10μg/kg腹腔注射，每周連續(xù)注射3次，共注射4w。其中第2組設(shè)為模型對(duì)照組；第3組為對(duì)照病毒AdNC組，第4組為AdshPAI治療組。于DMN注射后2 w末AdNC組和AdshPAI組分別經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入4×109pfu/只AdNC或AdshPAI至大鼠體內(nèi)。于DMN注射后第4 w末處死大鼠。分別采用組織病理方法觀(guān)察各組大鼠肝纖維化程度分級(jí)改變；肝組織切片采用Masson染色和天狼猩紅(sirius red)染色分析膠原沉積變化；

12、免疫組織化學(xué)法測(cè)定PAI-1、平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(α-smooth muscle actin，α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、MMP-9、TIMP-1、Brdu和PCNA表達(dá)，圖象分析儀半定量分析；real-time RT-PCR方法檢測(cè)肝組織中PAI-1、α-SMA、TGF-β1、Ⅰ型膠原、smad3、smad7、uPA、uPAR、tPA、MMP-2、MMP

13、-9、MMP-13和TIMP-1 mRNA水平；組織勻漿酸水解方法測(cè)定肝組織中羥脯氨酸水平；末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL法)檢測(cè)肝組織中細(xì)胞凋亡情況。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，結(jié)果以(-X±S表示。多組間采用One-WayANOVA分析，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn)；細(xì)胞周期分析采用X2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有非常顯著性。
　　 [結(jié)論

14、]
　　 1.針對(duì)大鼠PAI-1 mRNA的219 siRNA，對(duì)靶基因有較好的基因沉默效率，抑制效率可達(dá)85％。
　　 2.siRNA沉默PAI-1可顯著抑制HSC-T6活化、增殖，合成及分泌膠原。
　　 3.在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，PAI-1表達(dá)明顯上調(diào)，AdshPAI治療可下調(diào)PAI-1表達(dá)。
　　 4.AdshPAI治療可促進(jìn)膠原降解，減少肝纖維化大鼠肝內(nèi)膠原沉積，抑制肝纖維化發(fā)展。