尿激酶型纖溶酶原激活劑和肝細(xì)胞生長因子聯(lián)合基因治療實驗性肝纖維化.pdf

1、該研究選擇HGF和uPA作為外源目的基因，利用AdEasy<'TM>系統(tǒng)分別構(gòu)建表達(dá)HGF和非分泌型uPA的重組復(fù)制缺陷型腺病毒AdHGF和AduPA，通過體外、體內(nèi)實驗研究HGF和uPA聯(lián)合基因治療肝纖維化的效果，為多靶點(diǎn)協(xié)同治療肝纖維化提供實驗依據(jù).實驗方法：一、重組復(fù)制缺陷型腺病毒AduPA和AdHGF構(gòu)建及體外表達(dá).分別將HGF和uPA的表達(dá)質(zhì)粒酶切、PCR擴(kuò)增，獲取HGF和uPA cDNA片段.其中在uPA cDNA片段兩端分

2、別連接RR固定信號序列和KDEL信號序列進(jìn)行修飾，使其表達(dá)的uPA蛋白兩端能分別與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ、Ⅱ型跨膜蛋白相結(jié)合而固定于細(xì)胞內(nèi)，避免uPA大量分泌到細(xì)胞外，影響凝血功能.二、HGF和uPA基因過表達(dá)對細(xì)胞生物學(xué)特性影響.1.利用AdHGF導(dǎo)入外源HGF基因?qū)Ω渭?xì)胞增殖的影響：分離制備原代培養(yǎng)的Sprague-Dawley(SD)大鼠肝細(xì)胞，AdHGF以一定滴度體外感染肝細(xì)胞，利用RT-PCR法檢測肝細(xì)胞HGF和c-met/HGF受體

3、mRNA的表達(dá)，ELISA法測定培養(yǎng)上清HGF水平;繪制感染前后細(xì)胞增殖曲線;流式細(xì)胞儀測定基因?qū)肭昂蠹?xì)胞周期變化;免疫細(xì)胞熒光法檢測HGF基因?qū)牒笤鲋臣?xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）表達(dá)并計算PCNA指數(shù).2.利用AduPA導(dǎo)入外源uPA基因?qū)SC生物學(xué)特性的影響：AduPA以一定滴度感染肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，Northern印跡法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測uPA在HSC

4、中的表達(dá);ELISA法檢測培養(yǎng)上清MMP-2及TGF-β<,1>水平;免疫細(xì)胞熒光法測定Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的變化.三、AdHGF和AduPA體內(nèi)導(dǎo)入對實驗性肝纖維化的基因治療效果：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只.第1組予橄欖油（3ml/kg）皮下注射作為正常對照組;第2～6組為肝纖維化模型組，予40％四氯化碳（CCl<,4>）3ml/kg皮下注射，3天注射1次，首劑加倍，共注射18次.其中第2組設(shè)為模型對照組;第3組為空白病毒Ad

5、GFP對照組，于注射CCl<,4>8次后經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入4×10<'9>pfu AdGFP至大鼠體內(nèi);第4組設(shè)為AdHGF導(dǎo)入組，于注射CCl<,4>8次后經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入2×10<'9>pfu AdHGF+2×10<'9>pfu AdGFP;第5組為AduPA導(dǎo)入組，于注射CCl<,4>8次后經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入2×10<'9>pfu AduPA+2×10<'9>pfu AdGFP;第6組為AdHGF+AduPA聯(lián)合治療組，于注射CCl<,4>8次后

6、經(jīng)尾靜脈導(dǎo)入2×10<'9>pfu AdHGF和2×10<'9>pfu AduPA.CCl<,4>注射18次后處死大鼠，分別觀察各組大鼠肝功能指標(biāo)及凝血酶原時間（PT）變化，ELISA法測定血清Ⅲ型前膠原氨基端肽（PⅢP）和透明質(zhì)酸（HA）水平，免疫組織化學(xué)法測定HGF、uPA、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)，圖象分析儀半定量分析;肝組織切片采用HE和VG染色測定ECM含量并對肝纖維化程度分級.四、統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件

7、包進(jìn)行分析，結(jié)果以X±S表示.多組間采用One-Way ANOVA分析，方差非齊性則采用非參數(shù)檢驗;細(xì)胞周期分析采用X<'2>檢驗.P＜0.05為具有顯著性差異，P＜0.01為具有非常顯著性差異.結(jié)論：1.利用AdEasy<'TM>系統(tǒng)可快速構(gòu)建插入外源HGF和非分泌型uPA基因的重組復(fù)制缺陷型腺病毒并可在體內(nèi)外高效表達(dá).2.HGF基因?qū)氪笫蟾渭?xì)胞過表達(dá)后可上高c-met受體轉(zhuǎn)錄活性;誘導(dǎo)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞通過細(xì)胞周期G<,1>/S節(jié)點(diǎn)并增強(qiáng)

8、PCNA表達(dá)，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖.3.uPA基因?qū)氪笫驢SC細(xì)胞過表達(dá)后可提高培養(yǎng)上清MMP-2濃度，降低Ⅰ、Ⅲ型膠原含量.4.HGF體內(nèi)單獨(dú)導(dǎo)入可改善肝功能，降低肝纖維化大鼠肝內(nèi)ECM沉只，抑制肝纖維化發(fā)展.5.uPA體內(nèi)單獨(dú)導(dǎo)入亦可明顯減少ECM含量，但肝功能未有明顯改善，其對肝纖維化的主要作用是降解ECM.6.AduPA和AdHGF聯(lián)合基因治療既可明顯抑制ECM沉積，還能促進(jìn)肝功能恢復(fù)，治療效果優(yōu)于單基因?qū)胫委?，是治療實驗性肝纖維