尿激酶型纖溶酶原激活因子多環(huán)節(jié)促雄性生育作用及相關(guān)機(jī)制的實驗研究.pdf

1、尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-plasmingenactivator，uPA)與雄性生殖系統(tǒng)關(guān)系密切，能夠多方面影響精子功能，涉及精子排放、運動功能的獲得、活力改變、獲能、頂體反應(yīng)以及受精等多個方面。此外，作為內(nèi)源性趨化物質(zhì)誘導(dǎo)精子趨化性可能是uPA促雄性生育的一種新作用。精子趨化性是指精子沿著趨化物質(zhì)濃度遞增或遞減方向改變運動方向的能力，發(fā)生于精-卵接觸前的通訊中。精子趨化性對精-卵在正確時間和地點相遇有著重要意義。然

2、而，有關(guān)趨化物質(zhì)的化學(xué)特性至今還未清楚，可能是一種耐熱的小分子多肽。我們根據(jù)uPA的特點推測uPA可能是一種內(nèi)源性化學(xué)趨化物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)精子趨化性。 因此，我們研究了uPA體外對小鼠精子趨化性的誘導(dǎo)、以及對精-卵接觸前通訊和小鼠精子體外受精能力的促進(jìn)作用；然后進(jìn)一步從不同環(huán)節(jié)研究uPA促雄性生育作用的分子機(jī)制，包括誘導(dǎo)精子趨化性的分子機(jī)制、促精子獲能的能量機(jī)制、以及初步在體研究uPA在精子發(fā)生中的作用機(jī)制。從而探討uPA多環(huán)節(jié)促

3、雄性生育的作用，旨在為uPA在臨床應(yīng)用提供科學(xué)的理論基礎(chǔ)。 一、uPA促雄性生育作用的體外觀察 本部分的主要實驗?zāi)康氖茄芯縰PA能否在體外誘導(dǎo)小鼠精子趨化性；uPAR是否參與精子趨化性反應(yīng)；以及uPA在小鼠精-卵接觸前通訊和體外受精中的作用。從而探討uPA在促雄性生育中的新作用。 目前用于檢測精子趨化性的方法有4類：第一類趨化性測試是在一個遞增的梯度化學(xué)引誘劑上的精子聚集。在此類測試中，精子感受到—濃度梯度遞增的

4、化學(xué)趨化物質(zhì)，因而在化學(xué)趨化物質(zhì)或其附近聚集?；瘜W(xué)趨化物質(zhì)梯度是通過自由擴(kuò)散方式建立。第二類測試與第一類測試方法相反，即觀察精子在一個濃度梯度遞減的化學(xué)趨化物質(zhì)上離開的趨勢，主要測試精子離開而不是聚集在化學(xué)引誘劑上的趨勢。第三類測試包括“選擇”測試。這是最常見的測試方法之一，精子在分別含有化學(xué)趨化物質(zhì)和其它對照緩沖液的兩個孔中選擇。第四類測試是檢測精子運動軌跡。其中，第二類和第四類方法可以將精子趨化性與其他能夠引起精子聚集的原因區(qū)分開。

5、在此，我們選用第一和第二種方法來檢測體外小鼠精子對uPA的趨化性。首先，通過檢測精子在裝有濃度遞增或遞減uPA的毛細(xì)管內(nèi)聚集量的變化來測試小鼠精子體外對uPA和卵細(xì)胞的趨化性以及uPAR在其中的作用；然后，將卵細(xì)胞分別經(jīng)uPA、PAI-1以及抗uPAR抗體預(yù)處理后，檢測其趨化誘導(dǎo)精子能力的變化來反映uPA在精-卵接觸前通訊中的作用；最后，觀察精子經(jīng)uPA預(yù)處理后其受精能力的變化。實驗結(jié)果顯示：精子在遞減/遞增uPA濃度梯度中的聚集密度明

6、顯低于/高于在等uPA濃度梯度內(nèi)的密度(P＜0.05)；而抗uPAR抗體處理精子可使精子在遞增uPA濃度梯度中的聚集密度明顯降低。經(jīng)uPA預(yù)處理的卵細(xì)胞其聚集精子的能力顯著強(qiáng)于未經(jīng)處理卵細(xì)胞(P＜0.05)，而用PAI-1預(yù)處理卵細(xì)胞后，卵細(xì)胞聚集精子的能力則顯著下降(P＜0.05)；用抗uPAR抗體預(yù)處理卵細(xì)胞并不影響卵細(xì)胞對精子的聚集作用；uPA處理后的精子與卵細(xì)胞共孵育后所得受精卵數(shù)目多于未經(jīng)處理組的受精卵數(shù)目(P＜0.05)。

7、 綜上，我們得出以下結(jié)論：精子在體外對uPA和卵細(xì)胞均有趨化性；uPA能增加卵細(xì)胞對精子的趨化作用，增進(jìn)精-卵接觸前通訊，促進(jìn)受精。推測uPA作為一種內(nèi)源性的精-卵接觸前的通訊物質(zhì)，誘導(dǎo)精子改變運動方向，增加精卵接觸機(jī)會，進(jìn)而增加受精成功機(jī)率。本實驗第一次提出了uPA作為內(nèi)源性趨化物質(zhì)誘導(dǎo)精子趨化性可能是其一種新的促雄性生育作用，并為其在臨床上的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。 二、uPA促雄性生育作用的機(jī)制研究 從上面實

8、驗我們觀察到uPA在體外可以通過誘導(dǎo)精子趨化性，增進(jìn)精-卵接觸前通訊，提高小鼠精子體外受精率，從而多途徑地發(fā)揮促雄性生育作用。但uPA促雄性生育作用的機(jī)制卻不清楚。由于uPA與雄性生殖系統(tǒng)關(guān)系密切，所涉及的細(xì)胞功能事件及相應(yīng)機(jī)制極其復(fù)雜，在這里，我們僅從uPA誘導(dǎo)精子趨化性、促獲能、促精子發(fā)生三個不同方面來研究uPA促雄性生育作用的機(jī)制。 鈣離子通道是一種極為常見的信號通路，已在哺乳動物精子膜上鑒定出四類Ca2+通道。已有實驗顯

9、示精子尾部胞漿內(nèi)[Ca2+]i的變化與精子趨化運動有直接關(guān)系。此外，精子作為一種轉(zhuǎn)錄和翻譯活動都已經(jīng)終止了的終末分化細(xì)胞，蛋白磷酸化在精子生理活動中應(yīng)該發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。ERK1/2是一類細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，在體細(xì)胞的趨化遷移活動中發(fā)揮重要作用。因此，我們通過檢測對uPA產(chǎn)生趨化性的獲能小鼠精子胞漿內(nèi)[Ca2+]i和磷酸化ERK1/2蛋白水平的變化來探討uPA體外誘導(dǎo)小鼠精子趨化性的可能分子機(jī)制。采用毛細(xì)管法收集對uPA產(chǎn)生趨化運動

10、的小鼠獲能精子；對用于檢測胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度的那部分獲能精子先予以Fluo3-AM熒光染料負(fù)載。再根據(jù)uPA作用時間長短，將收集的精子分為0、5、30、60min4個時間組，定為實驗組；每個時間點都設(shè)一對照組(以BWW液替代毛細(xì)管內(nèi)的uPA)。然后分別用激光共聚焦顯微鏡和WesternBlot方法檢測各組精子胞內(nèi)的Ca2+熒光強(qiáng)度(經(jīng)Fluo3-AM負(fù)載過的趨化運動精子)和胞內(nèi)磷酸化ERK1/2蛋白水平(未經(jīng)Fluo3-AM負(fù)載的趨化

11、運動精子)。實驗結(jié)果顯示：實驗組的精子胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度在5min和30min顯著高于對照組(P＜0.05)；磷酸化ERK1蛋白水平在5、30min和60min，以及磷酸化ERK2蛋白水平在30、60min顯著高于對照組(P＜0.05)。因此我們認(rèn)為uPA誘導(dǎo)的小鼠精子趨化運動伴隨胞漿內(nèi)[Ca2+]i和ERK1/2蛋白磷酸化水平升高。推測uPA體外誘導(dǎo)精子趨化運動作用的分子機(jī)制與此有關(guān)。 獲能是精子發(fā)生頂體反應(yīng)以及完成受精活動

12、所必須的前提條件。精子伴隨獲能而發(fā)生的改變需要高能量支持。uPA能夠促進(jìn)精子獲能。在此，我們通過檢測uPA體外對獲能小鼠精子線粒體膜電位的影響來研究uPA促精子獲能作用的機(jī)制，進(jìn)而探討uPA促男性生育作用的可能機(jī)制。我們利用流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡和膜電位熒光染料JC-1來檢測精子線粒體膜電位。根據(jù)uPA作用與否將獲能精子分為實驗組和對照組；再根據(jù)uPA作用時間的不同，各組又分為5個亞組。分別將實驗組和對照組的獲能精子與uPA或BWW液共

13、孵育，于孵育的第0、5、15、30min和60min時加入JC-1繼續(xù)孵育20min，然后用流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測精子線粒體膜電位狀態(tài)。實驗結(jié)果顯示：JC-1熒光主要集中在精子尾部中段，顏色呈綠色、橙色和橙紅色不等；在uPA作用第5、15min時，實驗組內(nèi)精子平均熒光強(qiáng)度顯著增加，膜電位高的精子數(shù)百分比亦相應(yīng)增加(P＜0.05)；而在對照組，只有5min時的熒光強(qiáng)度略有升高，且無統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組在uPA作用5、15min時的膜電位

14、高的精子數(shù)百分比，以及15、30、60min時的精子平均熒光強(qiáng)度較對照組相同時間點顯著增加(P＜0.05)。因此，uPA在體外可以增加獲能小鼠精子的線粒體膜電位，并使線粒體膜電位升高狀態(tài)維持一段時間，從而為獲能精子提供充足的能量供應(yīng)，以適應(yīng)精子活力增加以及運動模式改變所需要的高能量消耗。推測uPA通過增加線粒體功能來促進(jìn)精子獲能、增加精子活力，從而提高精子受精的能力。此可能為uPA促男性生育的機(jī)制之一。 三、總結(jié) uPA

15、與雄性生殖系統(tǒng)關(guān)系密切，對多種精子功能都有促進(jìn)作用。在這里，我們第一次提出并證明uPA促雄性生育的另一新作用：作為內(nèi)源性趨化物質(zhì)在體外誘導(dǎo)精子趨化性，進(jìn)而增進(jìn)精-卵接觸前通訊以及增加小鼠精子體外受精率。同時，我們從精子趨化性、獲能、以及精子發(fā)生三個方面探討了uPA發(fā)揮促雄性生育作用的機(jī)制。實驗結(jié)果顯示：uPA誘導(dǎo)的小鼠精子趨化運動伴隨胞漿內(nèi)[Ca2+]i和ERK1/2蛋白磷酸化水平升高；uPA在體外可以增加獲能小鼠精子的線粒體膜電位，并

16、使線粒體膜電位升高狀態(tài)維持一段時間，從而為獲能精子提供充足的能量供應(yīng)，以適應(yīng)精子活力增加以及運動模式改變所需要的高能量消耗；在體腹腔注射uPA可以在轉(zhuǎn)錄和/或翻譯水平上調(diào)Erk1/2基因，促進(jìn)ERK1/2蛋白磷酸化。綜合本研究結(jié)果和已有的相關(guān)研究，我們認(rèn)為uPA能夠從多環(huán)節(jié)發(fā)揮促雄生育的作用；此外，針對uPA有可能研制成為抗雄性生育藥品從而在男性避孕中發(fā)揮重要作用，以及作為一種診斷試劑用于男性不育癥病因的查找和為人工輔助生殖技術(shù)提供優(yōu)質(zhì)