三鏈形成寡核苷酸對大鼠Sertoli細胞尿激酶型纖溶酶原激活因子的反基因研究.pdf

1、第一章大鼠uPA基因特異三鏈寡核苷酸的設(shè)計
　　 第一節(jié)大鼠uPA基因生物信息學(xué)分析及啟動子預(yù)測
　　 大鼠尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，uPA)與男(雄)性生殖調(diào)控具有密切關(guān)系(Liu，2007；明鈺& 熊承良，2006；王曉燕& 熊承良，2003)，而大鼠是常用的生育調(diào)節(jié)的動物模型，所以對大鼠uPA基因和蛋白的研究頗有意義。大鼠uPA cDNA與其

2、它物種的uPA cDNA相似，與小鼠、人類、狒狒和豬分別有86、76、76和70[％]的相同序列。在編碼區(qū)的相似性最高，分別為91、88、83和76[％]，但在非編碼區(qū)有很大的差異。大鼠uPA cDNA有編碼432個氨基酸的一個大的開放閱讀框，該蛋白的預(yù)測分子量為48KDa。與上述物種的uPA的氨基酸一致率為88、71、70和69[％]。如果忽略保守的氨基酸替代物，其一致性將更高，分別為98、93、93和84[％]。與人類和豬的uPA蛋

3、白不同，大鼠uPA沒有潛在的糖基化位點，但卻保留著生長因子、kringle、以及所有物種uPA擁有的絲氨酸蛋白酶活性區(qū)域。由于反基因技術(shù)的應(yīng)用需要一段盡可能不間斷的多聚嘌呤/嘧啶靶序列做為干擾靶位點，而且這種序列多存在于基因啟動子范圍內(nèi)，并與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合部位重疊并與基因表達的調(diào)控有關(guān)。但是對大鼠uPA基因目前尚缺乏系統(tǒng)的研究報道，我們對大鼠uPA基因進行預(yù)測分析表明：在轉(zhuǎn)錄起始位點上游27 bp處有一個非經(jīng)典的TATA盒，但該區(qū)域具有典

4、型的GC盒和啟動子區(qū)所常見的SP1和AP-1等結(jié)合區(qū)域，表明此區(qū)域為真核轉(zhuǎn)錄的核心啟動子所在區(qū)域。另外，在其核心啟動子區(qū)域內(nèi)，存在一個位于轉(zhuǎn)錄啟始位點的上游81 bp和一不典型的結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子并啟動轉(zhuǎn)錄的TATA盒子上游47 bp處含有25個堿基的嘌呤富集序列，此序列符合反基因技術(shù)的靶序列的要求。
　　 第二節(jié)三鏈形成寡核苷酸親和性測定
　　 在本節(jié)中，我們以一個含有多聚嘌呤/嘧啶的大鼠雙鏈uPA基因序列做為靶序列，采用[

5、γ-32P]ATP 末端標記的嘧啶鏈和稍微過量的充足的嘌呤鏈與所設(shè)計的三鏈形成寡核苷酸進行電泳遷移率(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)分析以測定其親和力(Kd)。結(jié)果表明，在實驗條件下，uPA 特異性的uPA-PO和uPA-PS 都形成了三鏈結(jié)構(gòu)，然而后者的親和性較前者差；uPA-PO和uPA-PS的Kd分別為10-7 M和10-6 M。
　　 第二章大鼠支持細胞的原代培養(yǎng)與

6、鑒定
　　 原代支持細胞培養(yǎng)是研究精子發(fā)生的有力手段，是研究精子發(fā)生以及此過程中支持-支持細胞和支持-生精細胞間相互作用的基礎(chǔ)。在本試驗中，在前人工作的基礎(chǔ)上，采用復(fù)合酶消化、低滲處理的方法進行了支持細胞的體外原代培養(yǎng)，并運用多種方法對支持細胞進行鑒定。我們建立了穩(wěn)定的支持細胞原代培養(yǎng)體系，可達到95[％]的純度，可以很好地應(yīng)用于后續(xù)的實驗研究。
　　 第三章TFOs 對大鼠支持細胞uPA基因的降調(diào)節(jié)
　　 第一

7、節(jié)大鼠uPA實時定量RT-PCR引物設(shè)計和方法建立
　　 為設(shè)計大鼠尿激酶SYBR Green I實時定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)的引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立檢測方法。我們通過基因庫獲取靶基因序列，收集分析相關(guān)生物信息數(shù)據(jù)，應(yīng)用Oligo 6.22設(shè)計引物，并進行實驗驗證：提取體外培養(yǎng)大鼠睪丸總RNA反轉(zhuǎn)錄后運用進行擴增；將擴增產(chǎn)物回收純化后，10倍倍比稀釋后做標準曲線；根據(jù)標準曲線的斜率、相關(guān)系數(shù)和熔解曲線分析進行條件優(yōu)化并進行可重復(fù)

8、性檢測。設(shè)計的引物長度為21bp；GC含量52.4[％]；上下游引物3'最穩(wěn)定二聚體和及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能量分別為-1.5、-0.40 kcal/mol和-3.5、-0.90 kcal/mol，引物間最穩(wěn)定二聚體為-3.1 kcal/mol。引物間Tm值和引物與產(chǎn)物Tm差值分別0.3℃和4.9℃；引發(fā)效率分別455和403。優(yōu)化后的25 μl反應(yīng)體系中各組分終濃度為：dNTP200μmol，Taq DNA聚合酶0.05U/μl，引物200nm

9、ol，Mgcl2 3mmol，SYBR GreenI 0.2×，cDNA 2μl(20ng)。反應(yīng)條件為：95 5min ℃預(yù)變性；95 30s ℃變性，58 ℃20s退火，72 25s ℃延伸，82 5s ℃采集熒光，38個循環(huán)，該體系具有101.0～108.7[％](斜率-3.299～-3.13)的擴增效率，線形相關(guān)系數(shù)范圍0.996～0.999?？芍貜?fù)性檢測中，三種不同濃度樣本的批內(nèi)變異和批間變異分別為0.05[％]，0.02[％

10、]，1.7[％]和1.78[％]，2.29[％]，3.54[％]。該引物能夠特異地實現(xiàn)對靶序列的檢測，優(yōu)化建立的SYBRGreen I 實時定量RT-PCR方法具有敏感性高、特異性強、重復(fù)性好、線性檢測范圍廣的特點，適于對大鼠尿激酶基因表達水平的檢測。
　　 第二節(jié)TFOs 對內(nèi)源性uPA基因表達的降調(diào)節(jié)
　　 在睪丸，尿激酶型纖溶酶原激活因子(urokinase-type plasminogen activator，u

11、PA)由支持細胞產(chǎn)生，它與血睪屏障(blood-testis-barrier，BTB)密切相關(guān)，被認為是潛在的避孕靶點。本研究中，應(yīng)用三鏈形成寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotides，TFOs)對體外培養(yǎng)大鼠支持細胞中的uPA的表達調(diào)節(jié)來進行研究。支持細胞在330nM的TFOs作用下，uPA在mRNA和蛋白活性都有顯著性地下降。而做為纖溶酶原激活因子的另一形式的tPA在一定程度的升高，彌補了總的Pas活性