人白介素-1受體拮抗劑融合蛋白的構(gòu)建、表達(dá)及生物學(xué)活性鑒定.pdf

1、IL1ra是生物體內(nèi)的一種天然的蛋白質(zhì)分子,與IL-1α、IL-1β同為IL-1家族的成員,其本身無任何激動劑的作用,但能特異性地與IL-1受體結(jié)合,從而拮抗IL-1的各種生物學(xué)效應(yīng)。一系列的證據(jù)證明IL-1在RA發(fā)病的慢性炎癥過程中具有重要的作用,IL1ra由于可以特異性地抑制IL-1的生物學(xué)功能,因此在RA的治療中備受重視。2001年,由Amgen公司生產(chǎn)的重組人白細(xì)胞介素1受體拮抗劑(rhIL1ra,藥品名稱Kineret)被美國

2、食品與藥品管理局(FDA)和歐洲EMEA批準(zhǔn)上市,用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)。但是,由于IL1ra相對分子質(zhì)量較小,半衰期短,使用過程中患者皮下注射rhIL1ra時,要達(dá)到需要的血藥濃度和治療效果需要反復(fù)給藥,一般每天注射一次,一個療程為半年,頻繁用藥加重了患者的身體、心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),因此臨床上急需研發(fā)長效的重組rhIL1ra。本研究旨在采用蛋白融合技術(shù)延長IL1ra在體內(nèi)作用的半衰期,設(shè)計(jì)了以人血清白蛋白(hunmanlseruma

3、lbumin,HAS)為載體蛋白融合IL1ra的融合蛋白。作為血漿的重要成分之一,HAS是許多內(nèi)源因子和外源藥物的載體,正常情況下不易透過腎小球。在血漿中的半衰期長達(dá)2周,體內(nèi)分布極廣而且沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性,因而是一種理想的生物活性蛋白載體。通過基因工程技術(shù)將HAS基因與IL1ra基因融合,以期獲得既不喪失IL1ra生物活性,且能顯著地延長其在血漿中半衰期的融合蛋白。這樣的融合蛋白能夠降低給藥頻率,發(fā)揮與IL1ra相似或更好的治療作用

4、。
　　 1.融合基因的構(gòu)建及鑒定
　　 用PCR法從人胎肝cDNA文庫獲得成熟態(tài)血清白蛋白基因,長度大約為1.8kb,再將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體中。再經(jīng)PCR獲得不同修飾的HAS、IL1ra基因,構(gòu)建HAS與IL1ra的融合基因,并克隆至pPIC9載體中。用PstI、XhoI、EcoRI酶切鑒定重組質(zhì)粒,再經(jīng)測序證明已成功構(gòu)建。
　　 2.畢赤酵母轉(zhuǎn)化及PCR法鑒定
　　 制作畢赤酵母GS11

5、5(SMD1168)感受態(tài)細(xì)胞,將用SalI線性化的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115(SMD1168)中。轉(zhuǎn)化后鋪于不含組氨酸的RDB平板,30℃培養(yǎng)3天后長出一批畢赤酵母轉(zhuǎn)化子。以重組酵母的基因組為模板,用5'-AOX1和3'-AOX1為引物進(jìn)行PCR檢測,電泳在2.2kb處有一明顯條帶。結(jié)果顯示HAS/IL1ra融合基因表達(dá)盒已經(jīng)成功的整合至酵母基因組中。
　　 3.畢赤酵母轉(zhuǎn)化子搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
　　 隨機(jī)挑

6、選的多個畢赤酵母轉(zhuǎn)化子,經(jīng)搖瓶培養(yǎng),誘導(dǎo)表達(dá)72h,電泳鑒定在84kD處出現(xiàn)目標(biāo)條帶的轉(zhuǎn)化子并保存。選取表達(dá)量最高的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),取誘導(dǎo)表達(dá)12h、24h、48h、72h的發(fā)酵液,離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。電泳鑒定發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)時間的延長,培養(yǎng)基中的分泌蛋白的量增多,在誘導(dǎo)72h時表達(dá)量最高,發(fā)酵液中HAS-G-IL1ra融合蛋白的濃度約為200mg/L。
　　 4.融合蛋白的純化
　　 離心收集發(fā)酵誘導(dǎo)表

7、達(dá)72h的發(fā)酵液上清,硫酸銨沉淀,重溶脫鹽處理后,經(jīng)親和柱、離子交換柱、凝膠柱純化后得到較純的融合蛋白。經(jīng)反相HPLC檢測其純度大于90％。
　　 5.WesternBlotting免疫印跡分析
　　 免疫印跡結(jié)果分析顯示凝膠電泳中的84kD條帶既能與兔抗HAS抗血清發(fā)生特異性結(jié)合,也能與鼠抗人IL1ra單克隆抗體之間發(fā)生特異性結(jié)合。說明融合蛋白同時具有HAS和IL1ra抗原性。免疫印跡的結(jié)果驗(yàn)證了融合蛋白中存在HAS和

8、IL1ra兩個結(jié)構(gòu)域。
　　 6.融合蛋白的生物學(xué)活性測定
　　 按中國藥檢所推薦方法用細(xì)胞株A375.S2來測定rhIL1ra的生物效價(jià)。生物學(xué)活性測定結(jié)果表明本研究構(gòu)建表達(dá)的HAS/IL1ra融合蛋白具有與IL1ra相似的活性,能拮抗IL-1對A375.S2細(xì)胞的殺傷作用,并且保護(hù)作用呈劑量依賴性。
　　 7.融合蛋白的藥代動力學(xué)
　　 對小鼠進(jìn)行皮下注射HAS-G-IL1ra融合蛋白,在不同時間點(diǎn)取

9、血,用ELISA方法對血樣進(jìn)行檢測,通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法得到融合蛋白的藥代動力學(xué)參數(shù):半衰期為8.125h、是rhIL1ra的17.6倍。清除率為0.182L/h/kg,是rhIL1ra的0.18倍。證實(shí)HAS-G-IL1ra融合蛋白具有長效性。
　　 8.融合蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定
　　 通過WesternBlotting、N-端氨基酸測序及圓二色譜分析,證實(shí)HAS-G-IL1ra融合蛋白具有正確的HAS和IL1ra氨基酸序列及結(jié)構(gòu)

10、特征。
　　 綜上所述:
　　 本研究成功構(gòu)建了HAS與IL1ra的融合基因,并在畢赤酵母表達(dá)體系中獲得成功表達(dá);經(jīng)SDS-PAGE、WesternBlotting、N端氨基酸測序及圓二色譜分析等方法證實(shí)畢赤酵母表達(dá)的HAS/IL1ra融合蛋白具有正確的HAS和IL1ra序列及結(jié)構(gòu);A375.S2細(xì)胞IL1殺傷抑制實(shí)驗(yàn)證明HAS-G-IL1ra融合蛋白具有與IL1ra相同的生物學(xué)活性;小鼠的藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示HAS-G-