人TRAIL分子胞外區(qū)的克隆、表達(dá)純化及生物學(xué)活性鑒定.pdf

1、TRAIL(TNF-relatedapoptosis-inducingligind)又叫Apo2L，是新近發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員，與TNF-α和FasL一樣能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。但TNF-α和FasL的細(xì)胞毒副反應(yīng)太大，無(wú)法應(yīng)用于臨床。TRAIL有較廣的抗癌譜，能誘導(dǎo)對(duì)FasL和放化療有抗性的細(xì)胞凋亡，尤其在其抗癌作用中最獨(dú)特的特征是只選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡，而對(duì)正常組織和細(xì)胞沒(méi)有顯著毒性效應(yīng)。這一特殊的選擇性使TRAI

2、L在腫瘤治療中具有很大的應(yīng)用前景，因此，有必要對(duì)其進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)。 TRAIL分子的活性部分位于第114～281氨基酸，近來(lái)有研究報(bào)道，氨基酸95位前的序列具有抑制TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能力，較短的重組可溶性TRAIL分子具有較高的生物學(xué)活性。胞外區(qū)41～281氨基酸片斷是全長(zhǎng)的可溶性TRAIL分子，含有胞外區(qū)的所有遺傳信息，目前尚未見(jiàn)有關(guān)這一片斷的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基因工程的原理和方法克隆編碼人胞外區(qū)41～281片斷的cDN

3、A，并將其插入原核表達(dá)載體pQE-80L中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，經(jīng)純化復(fù)性后，獲得有生物學(xué)活性的重組可溶性人TRAIL41～281分子(rhsTRAIL41～281)。這既能為下一步探討41～114氨基酸殘基間是否存在輔助的功能位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)，也有利于研究胞外區(qū)可溶性分子的長(zhǎng)短與其功能的關(guān)系，同時(shí)也可為臨床上多種惡性腫瘤的治療提供新型候選劑。 本文的主要研究方法、內(nèi)容及結(jié)論如下：①利用RT-PCR技術(shù)從HL-60細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增編碼人T

4、RAIL胞外區(qū)41～281氨基酸片斷的cDNA，經(jīng)DNA測(cè)序后證實(shí)，擴(kuò)增片斷的序列與GenBank報(bào)道的完全一致。 ②將測(cè)序正確的人TRAIL胞外區(qū)41～281氨基酸片斷的cDNA插入高效原核表達(dá)載體pQE-80L，限制性酶切鑒定結(jié)果表明，成功構(gòu)建了重組pQE-80L/hTRAIL41～281質(zhì)粒。 ③用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，IPIG誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，SDS-PAGE進(jìn)行鑒定。結(jié)果獲得相對(duì)分子量為30.5KD

5、a左右的特異表達(dá)蛋白，且表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的45％左右。 ④經(jīng)鑒定表達(dá)蛋白以包涵體的形式存在。對(duì)包涵體進(jìn)行分離溶解后，用Ni-NTA樹(shù)脂進(jìn)行純化，得到純度在90％以上的目的蛋白。 ⑤采用分步透析法復(fù)性蛋白，Westernblot證實(shí)該蛋白為rhsTRAIL41～281。通過(guò)凝膠過(guò)濾層析分離出復(fù)性蛋白的三種不同大小分子，分別與rhsTRAIL41～281的三聚體、二聚體和單體相對(duì)應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)這是目的蛋白。同時(shí)三聚體的存在

6、為rhsTRAIL41～281發(fā)揮其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。 ⑥選用Jurkat細(xì)胞，采用多種方法檢測(cè)rhsTRAIL41～281的體外抗腫瘤能力。rhsTRAIL41～281處理的Jurkat細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況通過(guò)顯微鏡觀察、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)和MTT試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。顯微鏡下觀察到Jurkat細(xì)胞表現(xiàn)出凋亡的形態(tài)學(xué)特征，同時(shí)臺(tái)盼藍(lán)和MTT試驗(yàn)結(jié)果也顯示rhsTRAIL41～281分子能有效抑制Jurkat細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且該作用有明顯

7、量效和時(shí)效關(guān)系。 應(yīng)用流式細(xì)胞儀和DNA斷裂實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明，rhsTRAIL41～281能有效誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且這一效應(yīng)呈良好量效與時(shí)效關(guān)系。DNA斷裂實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞出現(xiàn)了典型的DNA梯形條帶，這一凋亡的特征性變化進(jìn)一步證實(shí)rhsTRAIL41～281蛋白具有較好的抗腫瘤活性，并且提示該蛋白能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和殺傷腫瘤細(xì)胞，從而發(fā)揮其抗癌作用。 ⑦41