Latcripin-5的克隆表達(dá)、純化及其生物學(xué)活性的研究.pdf

1、香菇C91-3菌株是由我課題組多年篩選得到的一株藥用真菌。本實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過(guò)對(duì)香菇C91-3菌株轉(zhuǎn)錄組多年的測(cè)序和其功能的解析，從而初步的篩選出17條與細(xì)胞活性相關(guān)的基因。我們通過(guò)利用RACE(Rapid Amplificatioon of cDNA Ends，快速cDNA末端擴(kuò)增)技術(shù)獲得所篩選基因序列的全長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)研究關(guān)注的是經(jīng)帥選出的所有功能基因中的第5條基因，所以將其命名為latcripin-5基因（簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)P-5）。我們通過(guò)對(duì)lat

2、cripin-5基因的生物信息學(xué)比對(duì)，從而得出該基因具有降解核酸的作用。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)構(gòu)建香菇C91-3菌株pET32a(+)-latcripin-5的原核重組表達(dá)載體，并使原核重組表達(dá)載體在大腸桿菌Ecoli.R中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性的檢測(cè)，來(lái)確定香菇中具有對(duì)細(xì)胞核酸發(fā)生降解作用和生物活性作用的功能性蛋白。①通過(guò)生物信息學(xué)軟件尋找并確定Latcripin-5基因序列及其功能蛋白。

3、②將構(gòu)建的重組原核表達(dá)載體中的Latcripin-5基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌Ecoli.R中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行生物學(xué)活性及功能的鑒定，為探討其對(duì)細(xì)胞核酸作用的機(jī)制做好充分的準(zhǔn)備。
　　方法:
　　第一部分:
　?、?gòu)谋缓Y選出的香菇C91-3菌株中的菌絲體中提取全部的RNA，本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)結(jié)果，用RACE技術(shù)獲得latcripin-5基因全長(zhǎng)，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)Latcripin-5蛋白的理

4、化性質(zhì)、氨基酸組成進(jìn)行分析，并對(duì)Latcripin-5蛋白的功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。②將latcripin-5的功能域基因Endonuclease-NS克隆到原核表達(dá)載體pET32a(+)中，從而構(gòu)建出pET32a(+)-latcripin-5這種原核重組表達(dá)質(zhì)粒。③將此原核重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Ecoli.R中并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳和Westernblot的方法進(jìn)行鑒

5、定。④用鎳柱親和層析的方法來(lái)分離純化重組表達(dá)的Latcripin-5蛋白。
　　第二部分:
　　①把得到的純化的重組表達(dá)Latcripin-5蛋白進(jìn)行復(fù)性和除鹽以及濃縮，并將濃縮后的蛋白進(jìn)行濃度測(cè)定。②將得到的復(fù)性并濃縮后的蛋白與人類(lèi)基因組DNA作用，用酶切的方法檢測(cè)復(fù)性所得蛋白的活性的是否存在。③將已確定活性存在的不同濃度的Latcripin-5蛋白作用于人肺癌細(xì)胞A549和雞胚細(xì)胞，用MTT(Methyl Thiazol

6、y LtetraZolium，四甲基偶氮唑藍(lán))的方法測(cè)定Latcripin-5蛋白對(duì)細(xì)胞的抑制作用。④用33258熒光染色法、流式細(xì)胞術(shù)的方法檢測(cè)Latcripin-5蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的作用;用電鏡法檢測(cè)Latcripin-5蛋白對(duì)細(xì)胞的微型結(jié)構(gòu)的作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分:
　　①利用雙酶切的實(shí)驗(yàn)方法確定插入到pET32a(+)中的基因片段為latcripin-5的基因片段。通過(guò)對(duì)Latcripin-5

7、蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，證明Latcripin-5蛋白的結(jié)構(gòu)域?yàn)榉窍拗菩院怂醿?nèi)切酶(Endonuclease-NS)的結(jié)構(gòu)域。②運(yùn)用SDS-PAGE電泳和Western blot方法得到的結(jié)果顯示大腸桿菌Ecoli.R所表達(dá)的蛋白為L(zhǎng)atcripin-5蛋白。③SDS-PAGE電泳可以看出經(jīng)鎳柱親和層析的到了純化的目的蛋白。
　　第二部分:
　?、賁DS-PAGE電泳和Western blot結(jié)果顯示得到了復(fù)性除鹽并濃縮后的蛋白

8、。②測(cè)定表達(dá)蛋白濃度時(shí)我們運(yùn)用Bradford的方法，得到標(biāo)準(zhǔn)蛋白的直線方程為y=0.0537x+0.0021，R2=0.9950。③用重組表達(dá)的蛋白進(jìn)行酶切的方法得到的結(jié)果顯示，該蛋白對(duì)核酸具有濃度梯度、溫度梯度依賴性。④用MTT的方法檢測(cè)得到的結(jié)果顯示，不同濃度的Latcripin-5蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與對(duì)照組比較明顯的差異，而不同濃度此蛋白對(duì)雞胚細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用與對(duì)照組同樣比較有差異。⑤用流式細(xì)胞術(shù)得到的結(jié)果顯示，此蛋

9、白具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，Latcripin-5蛋白的濃度為200μg/ml時(shí)誘導(dǎo)凋亡的作用最強(qiáng);此蛋白對(duì)細(xì)胞周期檢測(cè)的結(jié)果顯示，在200μg/ml的Latcripin-5蛋白作用下目的蛋白作用后主要阻滯在細(xì)胞的G1期，G2期的細(xì)胞比例不變，S期的細(xì)胞所占比例減少。⑥33258熒光染色法觀察細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，細(xì)胞核有明顯的皺縮現(xiàn)象。⑦電鏡法檢測(cè)其對(duì)腫瘤細(xì)胞微型結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)生明顯的降解現(xiàn)象，細(xì)胞變大，胞漿濃度降低。

10、　　結(jié)論:
　?、賹y(cè)序得到的香菇C91-3菌株的全部轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行基因比對(duì)，根據(jù)基因功能注釋的初步結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)室成功獲得了latcripin-5基因的全長(zhǎng)。②本實(shí)驗(yàn)組成功構(gòu)建了pE T32a(+)-latcripin-5的重組質(zhì)粒;重組表達(dá)的Latcripin-5蛋白在大腸桿菌Ecoli.R中得到了成功表達(dá);Latcripin-5蛋白經(jīng)鎳柱親和層析的方法被成功純化。③Latcripin-5蛋白對(duì)人類(lèi)基因組核酸具有酶切作用，同時(shí)對(duì)