Hk-Fc融合蛋白的改良、表達(dá)及其生物學(xué)活性的初步研究.pdf

1、激肽釋放酶(Human Kallikrein,hK)廣泛存在于人體的腎臟、胰腺、唾液和尿液等處。目前,hK蛋白已被證明在體內(nèi)具有重要的生理調(diào)節(jié)作用,如舒張腦部血管、調(diào)節(jié)微循環(huán)、促進(jìn)血管新生、抗凝血等。因其在緩解腦部缺血、促進(jìn)供血恢復(fù)上的明顯作用,hK蛋白已經(jīng)被天普生化制藥有限公司開(kāi)發(fā)為治療急性腦梗塞的藥物。該藥物作為“國(guó)家一類新藥”正處在四期臨床試驗(yàn)中。
　　 但是由于該蛋白在人體內(nèi)代謝迅速,注射入人體的hK蛋白很快便會(huì)被分解。

2、病人需要在療程內(nèi)每天滴注一支hK蛋白制劑,這給病人和社會(huì)造成了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。因此,如何保持hK.蛋白在人體內(nèi)的持久活性、延長(zhǎng)其體內(nèi)半衰期是一個(gè)極有應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)價(jià)值的研究課題。
　　 人體免疫球蛋白IgG可以被木瓜蛋白酶水解為Fab和Fc兩個(gè)片段,其中Fc片段對(duì)延長(zhǎng)免疫球蛋白的血清半衰期有重要的作用。近年來(lái),將目的蛋白和Fc片段融合表達(dá),已經(jīng)成為延長(zhǎng)目的蛋白血清半衰期、增強(qiáng)蛋白生物學(xué)活性的一個(gè)有效手段。為了延長(zhǎng)hK蛋白血清半衰期,

3、本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將編碼hK的KLK基因和Fc序列相連接,裝入真核表達(dá)載體pcDNA3.1,最終表達(dá)出hK-Fc融合蛋白,驗(yàn)證其酶活性和半衰期的變化。同時(shí)為了獲得更有效率的hK-Fc融合蛋白,我們還在基因水平上對(duì)KLK基因進(jìn)行了如下改造:1.用強(qiáng)分泌的鼠源信號(hào)肽替換KLK基因天然的信號(hào)肽;2.剔除KLK基因的活性肽段區(qū)域,使得分泌到胞外的融合蛋白不需要蛋白酶激活便具有生物學(xué)活性。
　　 最后,我們篩選出大量表達(dá)hK-Fc和改良型的hK'