TAT蛋白轉導域-人FOXP3相關融合蛋白的制備及其生物學功能的初步研究.pdf

1、FOXP3是FOX(forkhead box)家族轉錄因子中的一員，是Treg細胞(Treg)的相對特異性標志，同時對Treg的發(fā)生、發(fā)育、功能的維持與發(fā)揮方面起關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)通過轉染表達外源性人FOXP3（hFOXP3）或鼠Foxp3（mFoxp3）可使非Treg細胞具有類似Treg細胞樣的表型及抑制Jurkat T細胞增殖功能。
　　 人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因編碼的反式激活蛋白（TAT）中的蛋白轉導結構域(

2、PTD)能夠高效、快速地攜帶外源性蛋白穿入幾乎所有的真核細胞，而進入細胞質。由于其具有核定位信號(NLS)，因此也能定位于細胞核內。同時PTD具有不影響其攜帶的目的蛋白功能的特點。
　　 目的：研究PTD-hFOXP3、PTD-eGFP-△E251 hFOXP3、PTD-eGFPhFOXP3融合蛋白對T細胞活化、增殖及其免疫調節(jié)功能的影響，為最終應用于器官移植和自身免疫性疾病治療藥物奠定基礎。
　　 方法：利用基因重組和

3、定點突變技術構建pET28a-PTD-hFOXP3、pET28a-PTD-eGFP-△E251 hFOXP3、pET28a-PTD-eGFP-hFOXP3原核表達載體，并在大腸埃希菌Rosetta(DE3)中表達融合蛋白，經Ni2+-IMAC親和柱純化融合蛋白和脫鹽柱除鹽獲得純化蛋白。Western-blot技術檢測融合蛋白表達的正確性，流式細胞術檢測融合蛋白穿越細胞膜進入人急性白血病T淋巴細胞瘤株JurkatT細胞中的能力和量效關系，

4、Western-blot分析和共聚焦顯微鏡觀察確認融合蛋白細胞內定位。通過淋巴細胞增殖抑制實驗初步分析融合蛋白對T細胞活化增殖的影響。
　　 結果：成功構建了pET28a-PTD-hFOXP3、pET28a-PTD-eGFP-△E251 hFOXP3、pET28a-PTD-eGFP-hFOXP3融合蛋白表達載體，表達并純化了人PTD-hFOXP3、PTD-eGFP-△E251 hFOXP3、PTD-eGFP-hFOXP3融合蛋白

5、。通過流式細胞術分析證實表達的融合蛋白均能高效的轉入細胞內，且發(fā)現(xiàn)融合蛋白在640nM，與細胞共育2h時蛋白穿入細胞的效率最高；經western-blot檢測和共聚焦顯微鏡觀察確認融合蛋白能夠進入細胞漿和細胞核；同時經細胞增殖抑制實驗證明PTD-hFOXP3和PTD-eGFP-hFOXP3融合蛋白能明顯抑制Jurkat T細胞的活化增殖能力。
　　 結論：成功表達具有生物學活性的PTD-hFOXP3、PTD-eGFP-△E251