Foxp3在黑素瘤細胞中表達的鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、惡性黑素瘤（Malignant Melanoma）是皮膚腫瘤的一種，90％來自于表皮的黑素細胞惡變，多由痣或色素斑發(fā)展而來。一旦進入進展期，則預后差、死亡率高，在致死性的皮膚惡性腫瘤中達到80％的比例。黑素瘤是所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的腫瘤，年增長率約3-5％，白色人種發(fā)病率高于其他膚色人種，中國等發(fā)病率較低的地區(qū)，近年來發(fā)病率增長迅猛，目前部分地區(qū)（北京和上海）的發(fā)病率統(tǒng)計顯示已達到1/10萬，發(fā)病年齡也趨于年輕化。黑素瘤具有惡性

2、程度高、進展快、早期易發(fā)生轉移且對放、化療均不敏感等特點。近年來，針對進展期黑素瘤進行了大量的免疫治療的研究，通過腫瘤疫苗和免疫細胞過繼等治療促進體內(nèi)腫瘤抗原特異性T細胞數(shù)量增加，體外實驗表明腫瘤抗原特異性T細胞可以攻擊并破壞腫瘤細胞，但臨床上出現(xiàn)腫瘤消退的患者很少。也有研究表明在黑素瘤腫瘤組織中存在活化的腫瘤抗原特異性T細胞，但不能有效破壞腫瘤細胞。由此現(xiàn)象，人們認識到黑素瘤腫瘤微環(huán)境中存在免疫耐受機制，其中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T

3、細胞（Treg）的存在是介導腫瘤微環(huán)境免疫耐受的重要因素。
　　機體免疫系統(tǒng)受多重調(diào)節(jié)，其中Treg發(fā)揮著重要免疫負調(diào)節(jié)作用，抑制自身反應性T細胞以維持免疫耐受，同時也抑制了腫瘤抗原特異性自身反應性T細胞發(fā)揮有效的抗腫瘤應答。Treg通過細胞接觸和分泌TGF-β和IL-10等免疫抑制性細胞因子等方式發(fā)揮免疫抑制功能。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)腫瘤組織中存在Treg，黑素瘤腫瘤組織中Treg的數(shù)量與患者的預后及生存率明顯負相關，通過清除或抑制Tr

4、eg可明顯促進腫瘤的消退和提高生存率，也可顯著提高腫瘤疫苗和細胞過繼免疫等治療的效果。
　　目前研究顯示Foxp3（Transcription factor forkhead box protein 3）分子是Treg唯一的標志性分子，對于Treg的發(fā)育和功能維持發(fā)揮重要的“總開關”的作用。小鼠和人的Foxp3基因突變，可引起Treg缺失，導致嚴重的自身免疫紊亂，異位表達Foxp3分子可使CD4+CD25-T細胞獲得全部或部分Tr

5、eg的表型和功能。Foxp3分子的表達曾被認為嚴格限制于T細胞系，近來有研究報告Foxp3也表達于胰腺癌細胞，并使胰腺癌細胞獲得部分Treg的表型和功能。我們推斷Foxp3分子也有可能表達于黑素瘤細胞，參與維持黑素瘤腫瘤微環(huán)境的免疫耐受。
　　我們?yōu)轵炞C該假設進行了以下實驗。目的：證實Foxp3分子是否表達于黑素瘤細胞，是否能夠抑制功能性T細胞的增殖和功能，明確其是否參與維持黑素瘤腫瘤微環(huán)境的免疫耐受狀態(tài)、逃逸機體免疫攻擊。方法：

6、通過RT-PCR檢測黑素瘤細胞系中Foxp3的mRNA轉錄，通過Western blot和流式細胞術檢測黑素瘤細胞系中Foxp3分子的表達，通過激光共聚焦檢測Foxp3分子在黑素瘤細胞內(nèi)的定位；通過免疫組織化學檢測Foxp3在黑素瘤組織中的表達、定位及其表達與Ki67之間的關系；對比研究干擾、過表達Foxp3后黑素瘤細胞的自身生物學特點的變化，同時檢測黑素瘤細胞免疫抑制相關分子表達量的變化、對外周血淋巴細胞增殖的影響。結果：證實在黑素瘤

7、細胞存在Foxp3的mRNA轉錄和分子表達，而作為對照的黑素細胞未檢測到Foxp3的表達，激光共聚焦顯示Foxp3分子定位于黑素瘤細胞的胞核和核周部位。黑素瘤組織病理切片的免疫組織化學證實Foxp3表達于黑素瘤細胞的胞核和核周、浸潤淋巴細胞的胞核，皮內(nèi)痣的黑素細胞未檢測到Foxp3的表達；連續(xù)切片的免疫組織化學結果分析顯示Foxp3的表達與Ki67的表達正相關。過表達Foxp3的黑素瘤細胞在體外培養(yǎng)時胞核分葉增多、突觸回縮、胞內(nèi)吞噬泡樣

8、結構增多，增殖速度減慢，而干擾組細胞此變化不明顯；過表達組和干擾組的細胞周期分析和凋亡檢測顯示無明顯差異；過表達組免疫抑制相關分子B7-H1和TGF-β家族分子的表達上調(diào)，與外周血淋巴細胞共培養(yǎng)實驗顯示黑素瘤細胞對CD4+CD25-T淋巴細胞增殖的抑制作用較正常對照組增強，而干擾組與之相反。結論：黑素瘤細胞系及黑素瘤組織中的黑素瘤細胞普遍存在Foxp3的表達，而原代培養(yǎng)的和皮內(nèi)痣組織中的黑素細胞未檢測到Foxp3的表達；黑素瘤細胞中的F

9、oxp3的表達與Ki67的表達明顯正相關；干擾、過表達實驗顯示黑素瘤細胞中Foxp3的表達量與部分免疫抑制相關分子的表達量以及抑制外周血淋巴細胞增殖的能力正相關。
　　綜上所述，我們認為黑素瘤細胞表達Foxp3是黑素瘤腫瘤微環(huán)境抑制免疫系統(tǒng)、逃逸免疫攻擊的一種新機制。本課題證實了黑素瘤細胞表達Foxp3，F(xiàn)oxp3的表達與黑素瘤細胞抑制免疫細胞的功能相關，但其發(fā)揮免疫抑制功能的具體機制還需要深入研究。Foxp3在黑素瘤細胞中作用機