Foxp3突變體相關融合蛋白的表達、純化、鑒定及生物學功能的初步研究.pdf

1、Foxp3是FOX(forkhead box)家族轉錄因子中的一員，是調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)的特異性標志，同時對Treg的發(fā)生、發(fā)育、功能的維持與發(fā)揮等方面起著關鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)表達外源性Foxp3可使非調節(jié)性T細胞具有類似調節(jié)性T細胞樣的表型及免疫抑制功能。Foxp3的突變可能導致調節(jié)性的CD4+CD25+T細胞介導的免疫耐受缺陷。
　　 HIV-1(humanimmunodeficie

2、ncy virus type1)基因編碼的反式激活蛋白( transactivator，TAT)中的蛋白轉導結構域(protein transduction domain，PTD)能夠攜帶外源性蛋白穿入幾乎所有的真核細胞膜而進入細胞漿和細胞核內，同時具有高效、快速的特點。
　　 目的：構建帶HIV-1穿膜序列原核表達載體pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGF

3、P-Foxp3，表達并純化小鼠PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白，研究融合蛋白導入細胞的效率及其對T細胞活化增殖的免疫調節(jié)功能的影響。
　　 方法：利用基因重組技術構建pET28a-PTD-△Foxp3、pET28aPTD-eGFP-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3原核表達載體，并在大腸埃希菌Rosetta(DE3)中表達融合蛋白，經(jīng)Ni2+分離柱純

4、化融合蛋白。Western-blot技術檢測融合蛋白表達的正確性，流式細胞術檢測融合蛋白穿越細胞膜進入小鼠T淋巴細胞瘤株EL-4細胞中的能力，并通過混合淋巴細胞反應初步分析融合蛋白對T細胞活化增殖的影響。
　　 結果：成功構建了pET28a-PTD-△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP△Foxp3、pET28a-PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白表達載體，表達并純化了PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3

5、、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白。通過流式細胞術分析證實表達的融合蛋白均能高效的轉入細胞內；同時經(jīng)混合淋巴細胞反應初步表明PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能明顯抑制T淋巴細胞的活化增殖能力，而PTD-△Foxp3、PTD-eGFP-△Foxp3突變體融合蛋白抑制T細胞活化增殖的能力喪失。
　　 結論：成功表達具有生物學活性的PTD-△Foxp3、PTD-eGFP△Foxp3、PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白，為進一