hGSTP1-1及其半胱氨酸突變體的原核表達載體構(gòu)建、誘導(dǎo)表達、純化和部分性質(zhì)研究和兩種EGFP-hsTRAIL融合蛋白表達載體的構(gòu)建、融合蛋白純化、生物學(xué)活性分析.pdf

1、第一部分：hGSTP1-1及其半胱氨酸突變體的原核表達載體構(gòu)建、誘導(dǎo)表達、純化和部分性質(zhì)研究 人胎盤型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST P1-1、GST-π、GST-pi)是人體內(nèi)GSTs的一種重要的活性亞型，因其首先在人體胎盤(placenta)中被克隆而得名。GST P1-1在多種腫瘤組織細胞和轉(zhuǎn)化的細胞株中豐度極高，且與腫瘤細胞的耐藥性密切相關(guān)。對GST P1-1的早期研究，集中在分子空間結(jié)構(gòu)及其多態(tài)性和催化活性與上述人類疾病的

2、關(guān)系，是目前人類GSqlS所有研究中最為廣泛和深入的一種亞型。 本實驗構(gòu)建了Ecoli重組表達載體pET-28a-His<,6>-hGST P1-1、 pET-28a-His<,6>-hGST P1-1<'C47A/C101A>、pET-28a-His<,6>-hGST P1-1<'C14A/C47A/C101A>、 pET-28a-His<,6>-hGST P1-1<'C14A/C47A/C101A/C169A、pET-28a

3、-His<,6>-hGST P1-1<'Y7F>和 pET-28a-His<,6>-rEK-hGST P1-1。并在Ecoli BL21(DE3)中實現(xiàn)了高效誘導(dǎo)表達，靶蛋白約占菌體總蛋白的30-50％。并初步建立了His<,6>-hGST P1-1蛋白純化工藝，利用該工藝路線我們可以從1 L細菌誘導(dǎo)物中最終獲得50-60 mg純度大于93％的 His<,6>-hGST P 1-1蛋白，轉(zhuǎn)移酶活性及對底物GSJ和CDNB親和常數(shù)K<,m

4、>與已報道的重組hGST P1-1和從人胎盤純化的hGST P1-1相似，為進一步研究His<,6>-hGST P1-1的性質(zhì)奠定了堅實的基礎(chǔ)。 實驗結(jié)果表明：hGST P1-1半胱氨酸的突變并未使酶的催化活性完全喪失，但在一定程度上抑制了hGST P1-1對底物GSH和CDNB親和力，因此半胱氨酸并不是hGST P1-1發(fā)揮轉(zhuǎn)移酶活性所必需的，但的確影響了酶的催化效率。另外，熱穩(wěn)定性研究推測Cys169在維持酶的熱穩(wěn)定性方面發(fā)

5、揮重要作用。研究揭示：hGST P1-1在氧化應(yīng)激時單體間通過Cys417和Cys101間形成二硫鍵，之后進一步使Cys14和Cysll69間形成單體間二硫鍵。 第二部分：兩種EGFP-hsTRAIL融合蛋白表達載體的構(gòu)建、融合蛋白純化、生物學(xué)活性分析 氧化型人胎盤型谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand， TRAIL/Apo2L)屬于

6、腫瘤壞死因子超基因家族成員。TRAIL及其受體在誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的同時，能保護正常細胞而免于細胞毒副反應(yīng)，是一種具有開發(fā)潛力的新的抗腫瘤藥物。 本實驗室從MegaMan<'TM>人轉(zhuǎn)錄組文庫(MegaMan<'TM> Human Transcriptome Library)中擴增得到了表達人腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(hTRAIL)胞外可溶性功能區(qū)(114位氨基酸殘基至281位氨基酸殘基，命名為sTR114和95位氨基酸殘基

7、至281位氨基酸殘基，命名為sTR95)的cDNA序列，通過重疊延伸PCR將TR95s和TR114s的cDNA序列分別與增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因融合，并將此融合基因克隆至pET-28a表達載體中。融合蛋白(EGFP-sTR95和EGFP-sTR114)誘導(dǎo)表達后通過IDA-Ni<'2+>親和層析柱純化得到的EGFP-sTR95和EGFP-sTR114這兩種融合蛋白在體外誘導(dǎo)多種腫瘤細胞系凋亡的活性。由于并融合蛋白保留了EGFP