Foxp3在小鼠腎移植免疫耐受中的研究.pdf

1、第一部分小鼠腎移植模型的建立
　　目的: 建立穩(wěn)定的小鼠腎移植模型，為利用小鼠研究移植免疫機制奠定基礎。
　　方法: 雄性、成年、健康、近交系C57BL/6小鼠40只。采用異位異體腎移植，充分暴露供腎，在摘取小鼠供腎前，先進行灌注。將移植腎動、靜脈分別與腹主動脈及下腔靜脈行端側吻合，尿道重建采用將供腎輸尿管末端引入膀胱內加外固定的方法。術后均不使用抗生素和免疫抑制劑。小鼠存活超過五天認為手術成功。
　　結果: 建模初期

2、共完成40例。僅有11例完成了手術全過程。建模成熟穩(wěn)定期共完成40例手術。術后24h小時存活率為85％(34/40).術后1w生存率為70％(28/40)。供體手術時間為(27±6) min，熱缺血時間約10～15s，供腎血管修整時間為(2.36±0.43)min.冷缺血時間(55±13) min，受體手術為(94±16) min，其中腹主動脈及下腔靜脈阻斷時間為（42.18±5.43）min.手術失敗的12只小鼠主要原因為出血性休克3

3、例，吻合口血栓形成5例，動脈吻合口狹窄2例，原因不明2例。
　　結論:
　　1采用改良方法建立的小鼠腎移植模型穩(wěn)定可靠，術后7天為本實驗的最佳研究時間，建模的成功可為后續(xù)實驗提供基礎。
　　2小鼠腎移植模型手術難度大，高質量的血管吻合以及細致的顯微操作是提高小鼠腎移植手術成功率的關鍵。
　　第二部分體外實驗中Foxp3對調節(jié)性T淋巴細胞抑制功能的研究
　　目的: 探討Foxp3轉染CD4+CD25-T細胞后

4、在體外淋巴細胞增殖反應的影響，并研究其在調節(jié)性T細胞中的作用機制。
　　方法: 免疫磁珠法分離出CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25T細胞，通過逆轉錄病毒載體體外介導Foxp3基因進入CD4+CD25-T細胞，RT-PCR檢測Foxp3的表達。以小鼠脾臟細胞為反應細胞，將Foxp3轉染的CD+CD25-T細胞、CD4+ CD25+調節(jié)性T細胞、脾臟單個核細胞為刺激細胞，各取5×105按照1∶1比例分為三組?；旌吓囵B(yǎng)三天后，加

5、入3H-TdR微居，以液閃測定儀測定三組的cpm值。
　　結果: Foxp3轉染后CD4+CD25-T細胞可見高水平的表達。Foxp3轉染CD4+CD25T細胞后具有與CD4+CD25+T細胞相同的抑制作用。三組cpm值比較:A組Foxp3（3，009.28±211.63）、調節(jié)性T細胞組（2877.11±121.43）增殖活性明顯低于空白對照組（12817.34±768.21），差異具有顯著性。Foxp3組與調節(jié)性T細胞組之間

6、無明顯差異。
　　結論:
　　1 Foxp3是CD4+CD25+T細胞發(fā)育、發(fā)生和功能的關鍵因子;
　　2 Foxp3轉染后的CD4+CD25-T細胞可明顯抑制淋巴細胞的增殖活化。
　　第三部分 Foxp3在小鼠腎移植模型中的作用研究
　　目的: 研究Foxp3在腎移植排斥反應中的作用和機制，探討在腎移植中通過Foxp3因子介導的CD4+CD25+T細胞實現特異性免疫耐受的可能性及機制。
　　方法:

7、建立小鼠腎移植模型后，實驗分為三組:A組:為對照組N=12，以脾臟單個核細胞為作用細胞，于移植前一天取1×106細胞注入受體小鼠體內。B組:調節(jié)性T細胞組，N=12，以CD4+CD25+調節(jié)性T細胞為作用細胞，同樣條件下，移植前一天取1×106經小鼠尾靜脈注入受體體內.C組:Foxp3+CD4+CD25-T細胞組，N=12，以PLXSN-mFOXP3-IRES2-EGFP轉染的CD4+CD25-T細胞為作用細胞;同樣條件下，于移植前一天

8、取1×106細胞經小鼠尾靜脈注入受體體內。A、B、C組分成2個亞組，一個亞組于7天術后處死，切取移植腎行病檢，下腔靜脈取血ELISA法檢測IL-2、IFN-γ、 IL-10的含量;一個亞組用于檢測小鼠移植術后生存期長短。
　　結果: 三組小鼠生存期長短比較:和A組比較，B、C組小鼠生存期明顯延長(P＜0.01);而B、C組之間比較未見顯著性差異。血清中IL-2、IFN-γ、IL-10在各組間的水平表達:IL-2、IFN-γ在A組水

9、平明顯高于B、C組。與B、C組間有明顯差異。IL-10在B、C組的表達水平明顯升高，與A組比較差異具有顯著性。IL-2、IFN-γ、IL-10在B、C組比較未見顯著差異。小鼠移植腎病理切片表達:A組小鼠出現明顯急性排斥反應;B組小鼠急性排斥反應明顯改善，未見明顯急性排斥反應組織學表現;C組小鼠急性排異反應同樣明顯改善，部分有輕度的缺血再灌注損傷。
　　結論:
　　(1) Foxp3在抑制腎移植急性排斥反應的發(fā)生發(fā)展過程中起著