Foxp3在小鼠腎移植免疫耐受中的研究.pdf

1、第一部分小鼠腎移植模型的建立
　　目的: 建立穩(wěn)定的小鼠腎移植模型，為利用小鼠研究移植免疫機制奠定基礎(chǔ)。
　　方法: 雄性、成年、健康、近交系C57BL/6小鼠40只。采用異位異體腎移植，充分暴露供腎，在摘取小鼠供腎前，先進行灌注。將移植腎動、靜脈分別與腹主動脈及下腔靜脈行端側(cè)吻合，尿道重建采用將供腎輸尿管末端引入膀胱內(nèi)加外固定的方法。術(shù)后均不使用抗生素和免疫抑制劑。小鼠存活超過五天認為手術(shù)成功。
　　結(jié)果: 建模初期

2、共完成40例。僅有11例完成了手術(shù)全過程。建模成熟穩(wěn)定期共完成40例手術(shù)。術(shù)后24h小時存活率為85％(34/40).術(shù)后1w生存率為70％(28/40)。供體手術(shù)時間為(27±6) min，熱缺血時間約10～15s，供腎血管修整時間為(2.36±0.43)min.冷缺血時間(55±13) min，受體手術(shù)為(94±16) min，其中腹主動脈及下腔靜脈阻斷時間為（42.18±5.43）min.手術(shù)失敗的12只小鼠主要原因為出血性休克3

3、例，吻合口血栓形成5例，動脈吻合口狹窄2例，原因不明2例。
　　結(jié)論:
　　1采用改良方法建立的小鼠腎移植模型穩(wěn)定可靠，術(shù)后7天為本實驗的最佳研究時間，建模的成功可為后續(xù)實驗提供基礎(chǔ)。
　　2小鼠腎移植模型手術(shù)難度大，高質(zhì)量的血管吻合以及細致的顯微操作是提高小鼠腎移植手術(shù)成功率的關(guān)鍵。
　　第二部分體外實驗中Foxp3對調(diào)節(jié)性T淋巴細胞抑制功能的研究
　　目的: 探討Foxp3轉(zhuǎn)染CD4+CD25-T細胞后

4、在體外淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響，并研究其在調(diào)節(jié)性T細胞中的作用機制。
　　方法: 免疫磁珠法分離出CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25T細胞，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體體外介導(dǎo)Foxp3基因進入CD4+CD25-T細胞，RT-PCR檢測Foxp3的表達。以小鼠脾臟細胞為反應(yīng)細胞，將Foxp3轉(zhuǎn)染的CD+CD25-T細胞、CD4+ CD25+調(diào)節(jié)性T細胞、脾臟單個核細胞為刺激細胞，各取5×105按照1∶1比例分為三組?；旌吓囵B(yǎng)三天后，加

5、入3H-TdR微居，以液閃測定儀測定三組的cpm值。
　　結(jié)果: Foxp3轉(zhuǎn)染后CD4+CD25-T細胞可見高水平的表達。Foxp3轉(zhuǎn)染CD4+CD25T細胞后具有與CD4+CD25+T細胞相同的抑制作用。三組cpm值比較:A組Foxp3（3，009.28±211.63）、調(diào)節(jié)性T細胞組（2877.11±121.43）增殖活性明顯低于空白對照組（12817.34±768.21），差異具有顯著性。Foxp3組與調(diào)節(jié)性T細胞組之間

6、無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1 Foxp3是CD4+CD25+T細胞發(fā)育、發(fā)生和功能的關(guān)鍵因子;
　　2 Foxp3轉(zhuǎn)染后的CD4+CD25-T細胞可明顯抑制淋巴細胞的增殖活化。
　　第三部分 Foxp3在小鼠腎移植模型中的作用研究
　　目的: 研究Foxp3在腎移植排斥反應(yīng)中的作用和機制，探討在腎移植中通過Foxp3因子介導(dǎo)的CD4+CD25+T細胞實現(xiàn)特異性免疫耐受的可能性及機制。
　　方法:

7、建立小鼠腎移植模型后，實驗分為三組:A組:為對照組N=12，以脾臟單個核細胞為作用細胞，于移植前一天取1×106細胞注入受體小鼠體內(nèi)。B組:調(diào)節(jié)性T細胞組，N=12，以CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞為作用細胞，同樣條件下，移植前一天取1×106經(jīng)小鼠尾靜脈注入受體體內(nèi).C組:Foxp3+CD4+CD25-T細胞組，N=12，以PLXSN-mFOXP3-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染的CD4+CD25-T細胞為作用細胞;同樣條件下，于移植前一天

8、取1×106細胞經(jīng)小鼠尾靜脈注入受體體內(nèi)。A、B、C組分成2個亞組，一個亞組于7天術(shù)后處死，切取移植腎行病檢，下腔靜脈取血ELISA法檢測IL-2、IFN-γ、 IL-10的含量;一個亞組用于檢測小鼠移植術(shù)后生存期長短。
　　結(jié)果: 三組小鼠生存期長短比較:和A組比較，B、C組小鼠生存期明顯延長(P＜0.01);而B、C組之間比較未見顯著性差異。血清中IL-2、IFN-γ、IL-10在各組間的水平表達:IL-2、IFN-γ在A組水

9、平明顯高于B、C組。與B、C組間有明顯差異。IL-10在B、C組的表達水平明顯升高，與A組比較差異具有顯著性。IL-2、IFN-γ、IL-10在B、C組比較未見顯著差異。小鼠移植腎病理切片表達:A組小鼠出現(xiàn)明顯急性排斥反應(yīng);B組小鼠急性排斥反應(yīng)明顯改善，未見明顯急性排斥反應(yīng)組織學(xué)表現(xiàn);C組小鼠急性排異反應(yīng)同樣明顯改善，部分有輕度的缺血再灌注損傷。
　　結(jié)論:
　　(1) Foxp3在抑制腎移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中起著