IDO基因過表達(dá)誘導(dǎo)小鼠肺移植慢性排異免疫耐受的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：肺移植是目前治療終末期肺病唯一有效方法，術(shù)后一年生存率可達(dá)71％，但5年生存率低于50%，為目前實(shí)體器官移植中最低。影響肺移植患者長期生存的主要原因?yàn)橐浦埠蟮穆耘女?，其特征性表現(xiàn)為閉塞性細(xì)支氣管炎(Obliterative Bronchiolitis，OB)，而現(xiàn)有的免疫抑制劑常無法逆轉(zhuǎn)。誘導(dǎo)供體或受體自身免疫抑制或免疫耐受，對(duì)預(yù)防和治療移植后急慢性排異的發(fā)生，延長移植物存活、提高受體的生活質(zhì)量都具有重要的意義。IDO（indo

2、leamine2,3-dioxygenase，吲哚胺2,3二加氧酶）為細(xì)胞內(nèi)一種色氨酸沿犬尿酸途徑分解代謝的限速酶，在誘導(dǎo)自身免疫疾病、母胎免疫耐受、腫瘤免疫逃逸及移植免疫耐受等方面均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，被稱為免疫抑制酶。研究發(fā)現(xiàn)，通過基因治療調(diào)控IDO的表達(dá)可以保護(hù)細(xì)胞和組織移植物，誘導(dǎo)產(chǎn)生移植后免疫耐受。本課題設(shè)計(jì)建立小鼠頸部異位氣管移植模型來模擬肺移植慢性排異過程，并構(gòu)建重組腺病毒IDO基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染供體小鼠氣道上皮，使之高表達(dá)

3、IDO，研究移植氣道上皮IDO過表達(dá)在減輕閉塞性細(xì)支氣管炎，誘導(dǎo)肺移植慢性排異免疫耐受中的作用及可能機(jī)制，為今后適用于臨床提供理論依據(jù)。
　　 第一部分Gateway技術(shù)構(gòu)建重組腺病毒IDO基因表達(dá)載體
　　 目的：利用Gateway分子克隆技術(shù)構(gòu)建含報(bào)告基因EGFP的重組腺病毒IDO基因表達(dá)載體，并對(duì)經(jīng)菌落PCR篩選、測序鑒定的重組腺病毒載體進(jìn)行病毒包裝、純化及滴度測定。
　　 方法：利用Gateway分子克隆

4、技術(shù)方案，由重疊PCR先擴(kuò)增、合成含attB1-kozak-IDO1/IRES/EGFP-attB2目的基因片段，再經(jīng)BP反應(yīng)合成pDown-IDO1/IRES/EGFP目的基因入門克隆，最終由LR反應(yīng)合成pAV.Ex1d-CMV＞IDO1/IRES/EGFP重組腺病毒目的表達(dá)載體。將以上經(jīng)菌落PCR篩選、測序鑒定正確的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293A包裝細(xì)胞擴(kuò)增，收集、純化含病毒顆粒上清液，采用TCID50法測定病毒滴度。
　　 結(jié)

5、果：基因測序鑒定經(jīng)菌落PCR篩選的pDown-IDO1/IRES/EGFP及pAV.Ex1d-CMV＞IDO1/IRES/EGFP載體質(zhì)粒，其基因序列與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)IDO基因序列完全一致。導(dǎo)入HEK293A包裝細(xì)胞后，可見報(bào)告基因EGFP亮綠色熒光蛋白表達(dá)。TCID50法測定病毒滴度為3.16×1010PFU/ml。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建含報(bào)告基因EGFP的重組腺病毒IDO基因表達(dá)載體，導(dǎo)入HEK293A包裝細(xì)胞后能產(chǎn)出高滴度的重組

6、腺病毒用于轉(zhuǎn)基因治療。
　　 第二部分IDO基因轉(zhuǎn)染小鼠氣道上皮的可行性研究
　　 目的：將攜帶IDO基因的重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠氣道上皮，觀察氣道上皮細(xì)胞IDO基因轉(zhuǎn)染的表達(dá)效率及酶活性；同時(shí)建立經(jīng)氣道病毒轉(zhuǎn)染模型，探討IDO基因活體轉(zhuǎn)染氣道上皮的可行性。
　　 方法：原代提取、培養(yǎng)小鼠氣道上皮細(xì)胞，行IDO基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)空載體轉(zhuǎn)染組和空白組對(duì)照。熒光顯微鏡下觀測各組氣道上皮細(xì)胞生物活性及

7、病毒轉(zhuǎn)染效率，并經(jīng)qRT-PCR、Western blot技術(shù)檢測上皮細(xì)胞IDO mRNA及蛋白表達(dá)水平。收集各組培養(yǎng)液上清，采用高效液相色譜法（HPLC）檢測上清液中色氨酸及犬尿氨酸含量以評(píng)估氣道上皮細(xì)胞中IDO酶活性。建立小鼠經(jīng)氣道病毒轉(zhuǎn)染模型，觀察小鼠氣道上皮IDO基因轉(zhuǎn)染的表達(dá)時(shí)效及生物安全性。
　　 結(jié)果：采用感染復(fù)數(shù)MOI=50病毒量體外轉(zhuǎn)染氣道上皮24h后，其轉(zhuǎn)染效率可達(dá)100%，但熒光較弱，提高M(jìn)OI值，熒光隨之

8、增強(qiáng)，而細(xì)胞狀態(tài)沒有太大的差異。qRT-PCR、Western blot檢測IDO基因轉(zhuǎn)染后氣道上皮細(xì)胞IDO mRNA及蛋白表達(dá)水平較空載體組、空白組明顯增高(P＜0.01)。經(jīng)氣道轉(zhuǎn)染腺病毒，IDO基因大部分表達(dá)于氣道上皮且持續(xù)時(shí)間超過3周，無呼吸系統(tǒng)損傷。HPLC檢測發(fā)現(xiàn)，無論培養(yǎng)液上清，還是氣道組織，IDO基因轉(zhuǎn)染組的IDO活性皆顯著高于空載體組和空白對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：攜帶IDO基因的腺病毒在體內(nèi)外皆

9、可穩(wěn)轉(zhuǎn)氣道上皮過表達(dá)IDO基因及蛋白，且具有酶活性。經(jīng)氣道途徑轉(zhuǎn)染腺病毒載體，氣道上皮轉(zhuǎn)染率、安全性高，時(shí)效可超過3周。
　　 第三部分IDO基因過表達(dá)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞／BMDCs免疫耐受
　　 第一節(jié)IDO基因過表達(dá)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖抑制
　　 目的：通過建立小鼠氣道上皮細(xì)胞與CD4+T細(xì)胞體外共培養(yǎng)體系，探討氣道上皮細(xì)胞IDO基因過表達(dá)對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖活性、早期凋亡的影響及在上調(diào)CD4+CD25+T

10、reg細(xì)胞FoxP3表達(dá)，誘導(dǎo)免疫耐受中的作用。
　　 方法：分別建立空白組、IDO轉(zhuǎn)染組、GFP轉(zhuǎn)染組、1-MT干預(yù)組小鼠氣道上皮細(xì)胞與磁珠分選、純化的CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)體系。經(jīng)CD3/CD28刺激共培養(yǎng)72h后，采用CCK8法、AnnexinV+ITC與PI雙染法檢測各組CD4+T細(xì)胞增殖活性、早期凋亡率。采用混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)、流式細(xì)胞分析檢測各組共培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞免疫功能及CD4+CD25+Treg細(xì)胞中F

11、oxP3表達(dá)變化。采用HPLC檢測各組共培養(yǎng)液上清中IDO活性。
　　 結(jié)果：經(jīng)體外刺激共培養(yǎng)72h后，CCK8法檢測IDO轉(zhuǎn)染組CD4+T細(xì)胞增殖刺激指數(shù)(SI)明顯低于對(duì)照組、GFP空載體組(P＜0.01)；當(dāng)加入IDO特異性抑制1-MT后，增殖指數(shù)明顯升高(P＜0.01)。AnnexinV-FITC與PI雙染法檢測IDO轉(zhuǎn)染組早期凋亡率明顯高于對(duì)照組、GFP轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)，加入1-MT后早期凋亡率下降(P＜0.01

12、)。流式細(xì)胞分析CD4+T細(xì)胞表型發(fā)現(xiàn)，IDO轉(zhuǎn)染組Treg細(xì)胞FoxP3表達(dá)比例顯著高于對(duì)照組、GFP空載體組(P＜0.01)；加入1-MT后，F(xiàn)oxP3表達(dá)下降(P＜0.01)。MLR檢測各組共培養(yǎng)后CD4+T細(xì)胞刺激脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯示：IDO轉(zhuǎn)染組脾淋巴細(xì)胞增殖抑制率明顯高于對(duì)照組、GFP空載體組(P＜0.01)，當(dāng)加入1-MT處理后，其刺激脾淋巴細(xì)胞增殖抑制率下降(P＜0.01)。HPLC檢測各組共培養(yǎng)液上清中IDO活性，其

13、IDO轉(zhuǎn)染組顯著高于對(duì)照組及GFP轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)；加入1-MT后IDO活性下降(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：共培養(yǎng)體系中，氣道上皮IDO基因過表達(dá)能明顯抑制CD4+T細(xì)胞活化增殖，誘導(dǎo)其凋亡；并可上調(diào)CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)FoxP3，產(chǎn)生免疫耐受；此種效應(yīng)為IDO依賴性，可被其阻滯劑1-MT所阻斷。
　　 第二節(jié)IDO基因過表達(dá)對(duì)BMDCs成熟分化的影響
　　 目的：體外擴(kuò)增、培養(yǎng)BMDCs

14、細(xì)胞，觀察其成熟、表型分化特點(diǎn)。通過建立小鼠氣道上皮細(xì)胞與BMDCs刺激共培養(yǎng)體系，探討氣道上皮細(xì)胞IDO基因過表達(dá)對(duì)BMDCs成熟、表型分化的影響及在誘導(dǎo)BMDCs免疫耐受中的作用。
　　 方法：采用rGM-CSF（10ng/ml）、rIL-4（4ng/ml）體外擴(kuò)增、培養(yǎng)BMDCs，觀察其形態(tài)學(xué)及表型成熟分化特點(diǎn)。于培養(yǎng)第7d分別建立與空白組、IDO轉(zhuǎn)染組、GFP轉(zhuǎn)染組、1-MT干預(yù)組小鼠氣道上皮細(xì)胞在LPS（1ug/ml）

15、刺激下共培養(yǎng)體系。72h后，采用流式細(xì)胞分析檢測各組BMDCs中MHCII、CD86/80表型分化變化，并由混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)評(píng)價(jià)其免疫功能，HPLC檢測各組共培養(yǎng)液上清中IDO活性。
　　 結(jié)果：體外擴(kuò)增、培養(yǎng)BMDCs，7d前為未成熟DCs，經(jīng)LPS(1ug/ml)刺激培養(yǎng)72h后可分化為成熟DCs。未成熟BMDCs與各組氣道上皮細(xì)胞經(jīng)LPS刺激共培養(yǎng)72h后，IDO轉(zhuǎn)染組BMDCs表面MHCII、CD80/86分子

16、表達(dá)明顯低于對(duì)照組、GFP轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)；加入1-MT后DCs細(xì)胞表面分子表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)。MLR評(píng)價(jià)各組共培養(yǎng)后BMDCs刺激脾淋巴細(xì)胞增殖能力顯示：IDO組BMDCs刺激脾淋巴細(xì)胞增殖率明顯低于對(duì)照組、GFP轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)；加入1-MT后，其刺激脾淋巴細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P＜0.01)。HPLC檢測各組共培養(yǎng)液上清中IDO活性，IDO組顯著高于對(duì)照組、GFP轉(zhuǎn)染組(P＜0.01)，加入1-MT后IDO活性下降(

17、P＜0.01)。
　　 結(jié)論：共培養(yǎng)體系中，氣道上皮細(xì)胞IDO基因過表達(dá)可明顯抑制BMDCs表面MHCII、CD80、CD86分子的表達(dá)，阻礙其進(jìn)一步分化成熟，誘導(dǎo)其產(chǎn)生耐受性。且此種效應(yīng)為IDO依賴性，可被其阻滯劑1-MT所阻斷。
　　 第四部分小鼠異位氣管移植模型模擬肺移植慢性排異
　　 目的：建立小鼠異位氣管移植模型來模擬肺移植后慢性排異特征性表現(xiàn)閉塞性細(xì)支氣管炎(OB)的病理過程，為研究肺移植慢性排異提供

18、實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。
　　 方法：30只小鼠隨機(jī)分入實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組，每組各15只，分別進(jìn)行小鼠頸部異位氣管移植。其中實(shí)驗(yàn)組受體為C57BU6(H-2b)近交系小鼠，對(duì)照組為BABL/c(H-2d)近交系小鼠，兩組供體氣管皆取自BABL/c近交系小鼠。各組分別于術(shù)后7d、14d、28d隨機(jī)處死5只受體鼠，取移植氣管進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)、CD3+T細(xì)胞免疫組化染色分析、并測定其氣管閉塞程度。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組移植氣道免疫病理損傷隨移植

19、時(shí)間延長而加重，28d移植氣道完全閉塞，與臨床閉塞性細(xì)支氣管炎的病理過程相似。實(shí)驗(yàn)組病理評(píng)分、CD3+T細(xì)胞浸潤及氣管閉塞程度顯著高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：小鼠異位氣管移植模型可模擬肺移植后慢性排異-閉塞性細(xì)支氣管炎的免疫病理過程。該模型操作簡單，建模穩(wěn)定，可用于肺移植慢性排異的相關(guān)研究。
　　 第五部分IDO基因過表達(dá)減輕肺移植慢性排異一閉塞性細(xì)支氣管炎的研究
　　 目的：在小鼠異位氣管移植模型

20、基礎(chǔ)上，探討小鼠移植氣道上皮IDO基因過表達(dá)在誘導(dǎo)肺移植慢性排異免疫耐受，減輕閉塞性細(xì)支氣管炎中的作用及可能的機(jī)制。
　　 方法：60只受體C57BU6(H-2b)小鼠隨機(jī)平均分入對(duì)照組、IDO轉(zhuǎn)染組、GFP轉(zhuǎn)染組、1-MT干預(yù)組，建立頸部異位氣管移植模型。供體移植氣管皆取自BABL/c(H-2d)小鼠，其中IDO組供體氣管經(jīng)重組IDO腺病毒轉(zhuǎn)染，GFP組供體氣管經(jīng)空載體轉(zhuǎn)染7d后移植。各組于術(shù)后7d、14d、28d隨機(jī)處死5只

21、受體鼠，取異位移植氣管進(jìn)行組織病理學(xué)、CD3+T細(xì)胞免疫組化檢查，并對(duì)IDO組移植氣管進(jìn)行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察移植后IDO基因表達(dá)情況。建模第7d，取各組移植氣管及旁淋巴結(jié)組織，進(jìn)行組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞增殖活性及Th17、Treg細(xì)胞流式檢測。實(shí)驗(yàn)?zāi)?，采用HPLC檢測外周血、移植氣管及旁淋巴組織內(nèi)IDO活性。
　　 結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)IDO組移植氣道免疫病理損傷明顯較其他組為輕，其病理評(píng)分、CD3+T細(xì)胞浸潤及氣管閉塞程度顯著

22、低于對(duì)照組、GFP轉(zhuǎn)染組、1-MT干預(yù)組(P＜0.05)。對(duì)IDO組移植氣管進(jìn)行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察：移植后IDO基因表達(dá)可持續(xù)4周。流式細(xì)胞檢測移植后7d氣道組織及旁淋巴結(jié)T細(xì)胞增殖活性，IDO組T細(xì)胞增殖率明顯低于其他各組，同時(shí)Treg細(xì)胞比例增多，Th17細(xì)胞比例相應(yīng)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。HPLC檢測移植氣道、旁淋巴組織及血漿內(nèi)IDO活性，IDO組明顯高于其他各組(P＜0.01)；而血漿內(nèi)各組IDO活性比較