BM-MSC誘導移植免疫耐受和修復慢性移植腎損傷的初步研究.pdf

1、本文從以下三部分進行了論述。
　　第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、純化、鑒定及體內(nèi)分布與輸注途徑的關(guān)系。
　　目的:探討骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)分離、純化和細胞鑒定的方法和超順磁氧化鐵(SPIO)標記BM-MSC方法的安全性及可行性，分析BM-MSC在體內(nèi)分布與細胞輸注途徑的關(guān)系，以確定BM-MSC的最佳輸注途徑。
　　方法:取西藏小型豬骨髓，采用密度梯度離心法對骨髓間充質(zhì)干細胞進行分離和純化，觀察其生長曲線。

2、對所獲取的細胞進行成脂、成骨誘導分化，并應用流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物CD45/CD90/CD105，以鑒定所純化細胞是否為BM-MSC。應用SPIO對BM-MSC進行體外標記，用MTT法檢測不同濃度SPIO對標記后細胞活力和增殖能力的影響。建立西藏小型豬同種異體腎移植模型，分別經(jīng)移植腎動脈和經(jīng)髂總靜脈輸注SPIO標記的BM-MSC，切取受體豬各器官，通過普魯士藍染色和透射電鏡觀察標記的BM-MSC在移植腎、肺臟及其他器官的分布情況。

3、
　　結(jié)果:應用梯度密度離心法可獲取高純度的BM-MSC，細胞具有良好的生長活力和傳代能力。BM-MSC可經(jīng)誘導向成骨細胞和脂肪細胞分化，應用茜紅素和油紅O染色可檢測出細胞中鈣結(jié)節(jié)和脂肪顆粒;經(jīng)流式細胞術(shù)檢測細胞表面標志物CD90陽性率為96.9％，CD105陽性率為95.7％，CD45陽性率為1.1％（陰性）。SPIO對BM-MSC的標記率接近100％，通過MTT法檢測25ug/ml的SPIO對BM-MSC的增殖能力影響較少、又

4、可有效標記細胞是比較適宜的標記濃度，50ug/ml的SPIO標記細胞2天后細胞活性減退。透射電鏡可觀察到BM-MSC細胞內(nèi)小囊泡包含的高密度鐵粒子。采用供腎動脈與髂總動脈、供腎靜脈與髂總靜脈端側(cè)吻合的方式成功建立西藏小型豬腎移植模型，將標記的BM-MSC分別經(jīng)移植腎動脈和髂總靜脈輸注后，觀察BM-MSC在受體豬體內(nèi)分布顯示:經(jīng)移植腎動脈輸注組，BM-MSC在移植腎內(nèi)定植的細胞數(shù)明顯多于經(jīng)髂總靜脈輸注組，且存在統(tǒng)計學差異;經(jīng)髂總靜脈輸注組

5、，肺內(nèi)的細胞數(shù)增加，有統(tǒng)計學差異。兩種輸注途徑均未發(fā)生血管栓塞、感染等并發(fā)癥。
　　結(jié)論:采用密度梯度離心法可獲取高純度、生長活力良好的BM-MSC;利用細胞外形特征、誘導定向分化和細胞表面標志物可成功鑒定BM-MSC;應用SPIO標記BM-MSC的方法簡便可行，易于細胞在體內(nèi)示蹤;經(jīng)移植腎動脈輸注BM-MSC是安全和理想的輸注途徑，有利于BM-MSC在移植腎內(nèi)定植、分化。
　　第二部分自體BM-MSC誘導親屬活體供腎移植免

6、疫耐受的臨床初步研究。
　　目的:通過對親屬活體腎移植受者輸注自體間充質(zhì)干細胞聯(lián)合應用低劑量FK506進行免疫誘導，觀察移植術(shù)后受者的移植腎功能、淋巴細胞亞群及比例和急性排斥反應發(fā)生率等指標，探討自體骨髓間充質(zhì)干細胞誘導移植免疫耐受的效果及其作用機制。
　　方法:隨機選擇2009.9-2012.9在我中心擬行親屬活體供腎移植的慢性腎功能不全（尿毒癥期）患者，按照納入標準入組，分為不輸注自體BM-MSC的對照組（10例）和輸注

7、自體BM-MSC的實驗組
　　（10例）。實驗組在術(shù)前1月行自體骨髓間充質(zhì)干細胞制備，分別在術(shù)中、術(shù)后1周和術(shù)后1月共3次輸注自體BM-MSC。首次在術(shù)中經(jīng)移植腎動脈輸注，細胞數(shù)5×106;術(shù)后1周和1月經(jīng)外周靜脈輸注，細胞數(shù)1×106/kg/次。對照組FK506初始劑量為0.08mg·kg-1·d-1，實驗組FK506初始劑量為0.04-0.05mg·kg-1·d-1，嗎替麥考酚和強的松用量兩組相同。術(shù)后動態(tài)觀察移植腎功能、24

8、小時尿蛋白、淋巴細胞計數(shù)和比例，應用流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞亞群及比例，并行程序性移植腎穿刺活檢，以觀察急性排斥反應的發(fā)生率等。
　　結(jié)果:采用梯度密度離心法可獲取高純度BM-MSC，其細胞表型為CD44+CD29+CD105+CD48+CD34+。20例受者手術(shù)成功，術(shù)后未發(fā)生移植腎動靜脈栓塞、DGF、感染、GVHD等并發(fā)癥。對照組中1例在移植術(shù)后7天發(fā)生急性血管性排斥反應并移植腎破裂，實驗組未發(fā)生急性排斥反應。實驗組與對照組均可

9、維持良好的移植腎功能（Cr和Ccr）;實驗組在術(shù)后早期（1周）24小時尿蛋白定量為308.1±55.1mg，低于對照組727.2±178.1mg，P＜0.05，有統(tǒng)計學差異;實驗組與對照組淋巴細胞計數(shù)和比例、NK細胞的比例、T淋巴細胞亞群CD3+CD4+、CD3+CD8+的計數(shù)和CD3+CD4+/CD3+CD8+比值、Treg細胞的比例在術(shù)后各時間觀察點（術(shù)后1周、1月、3月和6月）均無統(tǒng)計學差異，P＞0.05。
　　結(jié)論:自體骨

10、髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合低劑量FK506能獲得理想的移植腎功能，在早期可促進移植腎急性損傷的修復;可獲得有效的免疫抑制效果，對淋巴細胞計數(shù)和比例、NK細胞的比例、T淋巴細胞亞群計數(shù)及比值達到有效調(diào)節(jié);可以上調(diào)Treg細胞的比例，在一定程度上誘導移植免疫耐受。
　　第三部分修復慢性移植腎損傷的臨床實驗研究。
　　目的:通過對慢性移植腎腎病(CAN)的患者輸注骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSC)，觀察移植腎功能和移植腎間質(zhì)纖維化等指標的變

11、化，探討B(tài)M-MSC對慢性移植腎腎病患者移植腎功能的影響和修復慢性移植腎損傷的機制。
　　方法:選擇2009.12-2012.6確診為慢性移植腎腎病且符合納入標準的的患者10例，制備第三方健康骨髓間充質(zhì)干細胞，予CAN患者共三次輸注BM-MSC，輸注時間為0天、7天和1月。首次在DSA引導下經(jīng)移植腎動脈輸注，細胞數(shù)1.0×106/kg;第2、3次經(jīng)外周靜脈輸注，細胞量為5.0×106/kg。臨床觀察指標包括:Cr、BUN、Ccr、

12、24小時尿蛋白、血/尿β2微球蛋白。在治療前和治療后6月行移植腎活檢，應用JD圖像分析系統(tǒng)檢測腎間質(zhì)纖維化指標(LN、FN、TGF-β、CTGF)的變化。
　　結(jié)果:除1例患者在第2次輸注BM-MSC時出現(xiàn)過敏反應外，未發(fā)生出血、移植腎動脈栓塞、假性動脈瘤和感染等與BM-MSC輸注相關(guān)的并發(fā)癥。移植腎功能Cr和BUN在治療前為203.7±46.4umol/L、15.43±8.46mmol/L，治療后1周、1月分別為185.5±46

13、.2umol/L,12.15±4.96mmol/L和172.6umol/L、11.76±5.12mmol/L，與治療前比較有下降，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05;而3月及以后的移植腎功能Cr、BUN與治療前比較，差異無統(tǒng)計學意義。Ccr在治療后7天、1月、3月分別為43.18±18.04ml/min，43.18±18.04ml/min，48.04±22.34ml/min，較治療前38.01±12.96 ml/min增加，差異有統(tǒng)計學意義

14、，P＜0.05。治療后1月24小時尿蛋白定量為478.5±289.3mg，較治療前（105.6±327.3mg）減少，差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.05;治療后3月及以后則無統(tǒng)計學差異。腎間質(zhì)纖維化指標FN、LN在治療6月后的平均光密度值為（0.174±0.027，0.199±0.015）與治療前（0.182±0.019，0.212±0.013）相比有下降，但差異無統(tǒng)計學意義，P＞0.05; TGF-β和CTGF在治療6月后的平均光密度值為