小鼠Foxp3重組蛋白的表達、多抗制備及Foxp3在小鼠1型糖尿病模型中的表達研究.pdf

1、目的：構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3，并轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli BL21(DE3)中誘導表達，以純化蛋白為抗原免疫新西蘭兔制備抗小鼠Foxp3的多克隆抗體，對抗體進行滴度及特異性的分析。以制備的抗體為一抗Western-blot檢測小鼠1型糖尿病模型脾細胞中Foxp3的表達情況,為進一步研究Foxp3奠定了基礎(chǔ)。 方法： (1) 小鼠Foxp3重組蛋白的表達、純化和多抗制備 軟件分析小鼠Foxp

2、3基因，選取第532～1008bp位堿基序列為目的基因，其編碼產(chǎn)物159aa具有強抗原性及高特異性。以pMIGR1/ Foxp3重組質(zhì)粒為模板，PCR擴增目的片斷，將目的片斷克隆至原核表達載體pGEX-6p-2，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3，經(jīng)酶切、PCR及測序鑒定后轉(zhuǎn)化至表達宿主菌E.coli BL21(DE3)中誘導表達，SDS-PAGE和Western-Blot 鑒定表達產(chǎn)物；對重組融合蛋白（目的蛋白和GST蛋白）進

3、行大量誘導表達，用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱純化，SDS-PAGE和Western-Blot 分析和鑒定純化蛋白，采用BCA試劑盒測定純化蛋白濃度；用純化的重組融合蛋白免疫新西蘭兔，制備抗血清；采用 ELISA法測定抗血清效價；利用脂質(zhì)體法分別轉(zhuǎn)染pMIGR1/Foxp3及pMIGR1入NIH3T3細胞，提取轉(zhuǎn)染細胞的總蛋白, 以制備的多抗為一抗進行Western-blot法檢測NIH3T3轉(zhuǎn)染細胞表達的Foxp3，對制備的多抗進行特異

4、性分析。 (2) Foxp3在小鼠1型糖尿病模型中的表達研究 用STZ誘導小鼠1型糖尿病模型，嚴密觀察飲食情況，定期稱體重，測量尿糖及血糖變化，制作胰腺、胃黏膜及甲狀腺組織的病理切片以觀察其病理改變；流式細胞術(shù)檢測脾細胞中CD4+T細胞和CD4+CD25+T細胞數(shù)量的變化；RT-PCR、半定量Western-blot分別在mRNA、蛋白水平檢測小鼠脾細胞中Foxp3的表達。 結(jié)果： PCR擴增得到長477bp的目

5、的片斷；構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-6p-2/Foxp3經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定證明其中插入片段為目的基因；含pGEX-6p-2/Foxp3重組菌經(jīng)IPTG誘導，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，得到一分子量約45kDa的重組融合蛋白GST-Foxp3，用GST瓊脂糖凝膠FF純化柱對重組融合蛋白進行純化；Western-blot鑒定誘導表達的蛋白及純化蛋白能被抗GST單抗識別，在45kDa附近有特異條帶，與預期融合蛋白大小一致；以純化的Foxp

6、3重組融合蛋白為抗原免疫新西蘭兔制備抗Foxp3抗體，ELISA法檢測所得抗體效價在1∶12 800以上，Western-blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pMIGR1/Foxp3的NIH3T3細胞總蛋白能被抗小鼠Foxp3多抗特異性識別，而轉(zhuǎn)染pMIGR1的NIH3T3細胞總蛋白未出現(xiàn)任何條帶；STZ 誘導的小鼠1型糖尿病模型組與正常組及對照組相比，有明顯的多飲、多食、多尿和體重減輕等典型的糖尿病表現(xiàn)；模型鼠在造模1月后出現(xiàn)不同程度的尿糖改變，血

7、糖水平也顯著升高，胰島有不同程度的胰島炎性改變，而其它兩組尿糖均陰性，血糖水平正常，胰島未發(fā)生病理改變；流式分析T淋巴細胞亞群在小鼠脾細胞中的比例在各組之間變化明顯，用STZ致誘小鼠糖尿病后，CD4+T細胞顯著升高，而CD4+CD25+T細胞在模型組小鼠脾細胞中的比例也較正常組及對照組稍有升高，但是模型組CD4+CD25+T與CD4+T細胞的比值較正常組及對照組顯著偏低；RT-PCR檢測小鼠脾細胞中Foxp3 mRNA的表達水平，模型組

8、小鼠的脾細胞中Foxp3 mRNA的表達與內(nèi)參（G3PDH）的比稍高于正常組及對照組；半定量Western-blot 結(jié)果顯示模型組的脾細胞中Foxp3在蛋白水平的表達量亦稍高于正常組及對照組。 結(jié)論： (1)成功構(gòu)建了pGEX-6p-2/Foxp3原核表達載體，其在大腸桿菌BL21(DE3)中表達出一分子量約為45kDa的重組融合蛋白； (2)誘導表達的重組融合蛋白具有較好的免疫原性，能刺激新西蘭兔產(chǎn)生高效