FoxP3對甲狀腺乳頭狀癌中NIS表達的影響及機制研究.pdf

1、背景：
　　甲狀腺乳頭狀癌（Papillary thyroid carcinoma，PTC）是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，其預后通常較好，十年生存率約達90％。甲狀腺癌術后，放射性碘治療是其常規(guī)后續(xù)治療手段，但一些病人表現(xiàn)出對放射性碘治療耐受。目前有大量文獻指出病人這種對放射性碘治療的耐受與位于甲狀腺細胞膜的鈉碘轉(zhuǎn)運體（sodium iodine symporter, NIS）表達下調(diào)有關。NIS介導了碘由細胞外向細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，為

2、甲狀腺激素的合成提供了原料，其表達主要受TSH的調(diào)控，TSH不僅能促進NIS的表達水平，而且能使其正確定位于細胞膜上。除TSH外，轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor, TGF-β1），雌激素和碘在NIS的調(diào)節(jié)上也起著重要作用；其中，TGF-β1主要通過拮抗TSH的生物學效應來發(fā)揮其抑制甲狀腺功能及 NIS表達的作用。Smads家族是一類細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導因子，主要位于 TGF-β信號通路的下游發(fā)揮作用。T

3、GF-β1首先結(jié)合到細胞表面一種特異性激酶(TGF-βtype II receptor, TβR-II)上，從而導致了TβR-I的激活，后者又使R-Smad2和 R-Smad3磷酸化，磷酸化的R-Smad2和 R-Smad3繼而與Smad4共同轉(zhuǎn)移到細胞核中調(diào)節(jié)相應基因的表達。
　　叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子P3（Forkhead box P3，F(xiàn)oxP3)是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細胞(Tregs)生長和分化的重要調(diào)節(jié)因子。一直以來都認

4、為 FoxP3僅限定于 Treg細胞中特異性表達，直到Hanz在胰腺癌細胞中亦發(fā)現(xiàn)了它的表達，接下來在多種癌細胞株中都發(fā)現(xiàn)其有不同程度的表達。FoxP3在腫瘤細胞中能夠模仿其在Treg細胞中的功能，它通過促進免疫抑制性細胞因子如 TGF-β1分泌來抑制腫瘤特異性 T細胞，從而使腫瘤逃離機體的免疫監(jiān)視。此外，有研究顯示 FoxP3高表達和病人對放射性碘治療抵抗有關。
　　由于病人對放射性碘治療的耐受與NIS表達下調(diào)有關，且FoxP3

5、在多種腫瘤中都能促進TGF-β1分泌，而TGF-β1又是NIS表達強有力的抑制因子，因此推測FoxP3可能通過誘導 TGF-β1信號通路的激活來下調(diào)NIS的表達。在本研究中，采用免疫組織化學和熒光定量PCR檢測90例甲狀腺乳頭狀癌標本和40例正常甲狀腺組織中 FoxP3和 NIS的表達。此外，本研究組成性激活型（Constitutively active，CA）FoxP3過表達慢病毒載體來上調(diào)FoxP3的表達及活性，觀察在甲狀腺乳頭狀癌

6、細胞中FoxP3對NIS表達水平的影響。
　　目的：
　　1．探討FoxP3與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理特征及NIS表達的關系；
　　2．觀察FoxP3對人甲狀腺乳頭狀癌細胞中NIS表達的影響，并對其機制進行初步探討。
　　方法：
　　1.采用免疫組織化學和熒光定量PCR檢測90例甲狀腺乳頭狀癌標本和40例取自癌對側(cè)葉的正常甲狀腺組織中FoxP3和NIS的表達。
　　2.人甲狀腺乳頭癌細胞株TPC-1于含

7、10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用不同濃度的人重組TGF-β1(1,5,10 ng/mL)處理后，Real-time PCR檢測NIS mRNA的表達，Western blot檢測其蛋白水平的表達。
　　3.構建含組成性激活型（Constitutively active，CA）FoxP3編碼序列的慢病毒載體（LV-CA-FoxP3）及空慢病毒載體（LV-NC-GFP），并轉(zhuǎn)染于TPC-1，倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達，流式

8、細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　4.將細胞分為對照(NC)組，過表達 FoxP3(LV-CA）組及空病毒載體（LV-NC）組，Real-time PCR檢測FoxP3和TGF-β1的mRNA表達；Western blot檢測FoxP3, TGF-β1及TGF-β1通路下游重要成員TβR-I, Smad3和pSmad3的蛋白表達；免疫熒光檢測FoxP3, TβR-I和Psmad3的表達；ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液的TGF-β1水平。

9、r>　　5.將細胞分為對照組，LV-CA組，LV-CA加不同濃度的 TGF-β1單克隆抗體組（1μmol/L，5μmol/L，10μmol/L）以及LV-NC組，Real-time PCR檢測六組細胞NIS mRNA的表達，Western blot檢測其蛋白的表達。
　　結(jié)果
　　1．免疫組化結(jié)果顯示FoxP3在甲狀腺乳頭狀癌中的陽性率為74%，而在正常組織中均為陰性表達，且FoxP3與甲狀腺外侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05

10、)有關。
　　2．在正常甲狀腺組織中NIS主要定位于細胞膜，在腫瘤組織中其表達顯著減少，尤其在FoxP3陽性的樣本中，并且這些低表達的NIS主要定位于胞漿中。
　　3．免疫組化結(jié)果顯示甲狀腺乳頭癌中FoxP3陽性患者的NIS表達陽性率顯著低于FoxP3陰性患者（P<0.05）。Real-time PCR結(jié)果顯示甲狀腺乳頭癌中FoxP3陽性患者NIS的mRNA水平顯著低于FoxP3陰性患者（P<0.05）。
　　4.與對

11、照組相比，隨著培養(yǎng)基中TGF-β1濃度的增加，NIS的mRNA和蛋白表達均逐漸減少；當TGF-β1的濃度達到最大（10 ng/mL）時，NIS的mRNA和蛋白含量分別下降至對照組的6倍和2倍。
　　5．倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示 LV-CA和 LV-NC組細胞中表達大量的GFP，而未轉(zhuǎn)染組細胞不表達。流式細胞儀顯示對照組，LV-CA-FoxP3組和LV-NC組的GFP陽性率即轉(zhuǎn)染效率分別為0.2%，99.3%和99.3%。

12、　　6．與對照組相比，LV-CA組FoxP3和TGF-β1的mRNA和蛋白表達顯著增加（P<0.05）；ELISA結(jié)果顯示與對照組相比，LV-CA組細胞上清液中TGF-β1的分泌顯著增加（P<0.05）；Western blot結(jié)果顯示LV-CA組TβR-I和pSmad3的蛋白表達較對照組顯著增加（P<0.05），而Smad3無明顯變化。
　　7．免疫熒光結(jié)果顯示，F(xiàn)oxP3在LV-CA組細胞中大量表達，且主要位于細胞核中，而在正

13、常組和 LV-NC組細胞中 FoxP3的表達量則很低。與正常組和LV-NC組細胞相比，LV-CA組細胞的TβR-I和pSmad3表達水平顯著增強，而Smad3的表達在三組細胞間無統(tǒng)計學差異。
　　8．與NC組相比，LV-CA-FoxP3組NIS的 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，但隨著TGF-β1單克隆抗體濃度的不斷增加，NIS的mRNA及膜蛋白表達均逐漸恢復至接近正常。
　　結(jié)論：
　　1.FoxP