NFAT1、Foxp3在再障患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)及臨床意義.pdf

1、再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)簡(jiǎn)稱再障，是一組由化學(xué)、物理、生物、藥物及不明因素引起的骨髓造血干/祖細(xì)胞與造血微環(huán)境損傷，導(dǎo)致骨髓造血功能衰竭及外周血全血細(xì)胞數(shù)量減少的一種疾病。由于病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，故治療較困難，是兒童常見的難治性血液病之一。再障發(fā)病機(jī)理較為復(fù)雜，以往學(xué)者多認(rèn)為，造血干細(xì)胞損傷、造血微環(huán)境缺陷和免疫介導(dǎo)因素導(dǎo)致了再障的發(fā)生，此三種發(fā)病機(jī)制在不同的患者體內(nèi)單獨(dú)存在或聯(lián)合作用，導(dǎo)致造血功能

2、衰竭。目前越來(lái)越多的臨床及實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，免疫系統(tǒng)的紊亂包括T淋巴細(xì)胞數(shù)量和功能異常所造成的造血抑制，在AA的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。臨床資料顯示約70％左右再障患者應(yīng)用免疫抑制劑如抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)/抗淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG)及環(huán)孢菌素(CsA)治療有效，提示了免疫功能異常因素介導(dǎo)的造血抑制在再障發(fā)病中的重要作用。
　　 近年來(lái)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，它在維持外周免疫耐受

3、中起著重要作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞與多種自身免疫性疾病、移植排斥、腫瘤及病毒感染相關(guān)。國(guó)外有學(xué)者研究表明，CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞被分為三個(gè)表型：CD25hig+、CD25intermediate+和CD25low+。具有免疫抑制功能的Tregs高表達(dá)IL-2Rα(CD25)，另外也表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，其表型顯示為CD4+CD25high。最近國(guó)內(nèi)學(xué)者在分析中國(guó)健康人外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)

4、胞表達(dá)頻率時(shí)，采用三色免疫熒光染色分析技術(shù)分選了具有CD4+ CD25int/highCD127low表達(dá)特征的細(xì)胞群。經(jīng)胞內(nèi)Foxp3染色的結(jié)果亦證實(shí)：CD25int/highCD127low表達(dá)的細(xì)胞Foxp3陽(yáng)性，而CD25lowCD127hig細(xì)胞幾乎全部Foxp3表達(dá)陰性。由此提示CD25int/highCD127low可作為Treg細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志物而用于Treg的分選。
　　 轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及活化的T細(xì)胞核

5、因子(NFAT)在Treg的發(fā)育和分型中起重要的作用。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)：Foxp3決定了調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能，且Foxp3可能通過翻譯水平來(lái)改變調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制功能?；罨疶細(xì)胞核因子(NFAT)是T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中非常關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。NFAT家族主要包括NFAT1、NFAT2、NFAT3和NFAT4四個(gè)成員。Solomou等發(fā)現(xiàn)：再生障礙性貧血患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中Treg的表達(dá)降低，F(xiàn)oxp3在蛋白水平和mRNA水

6、平也是顯著降低的，同時(shí)伴隨著NFAT1蛋白的降低，并且NFAT1蛋白的低表達(dá)可能可以解釋Foxp3的低表達(dá)和Treg的減少頻率。而目前國(guó)內(nèi)關(guān)于Foxp3、NFAT1蛋白在兒童再障發(fā)病機(jī)制中的作用、兩者之間的關(guān)系及其與再障預(yù)后的聯(lián)系尚少見報(bào)道。
　　 目的：
　　 本研究應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫印跡試驗(yàn)(Western-blotting)的方法檢測(cè)慢性再障(CAA)患兒及正常兒童外周血單個(gè)核細(xì)胞中Treg細(xì)胞及在其發(fā)育和分型中

7、起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及NFAT1在蛋白水平的表達(dá)，探討它們之間的相互關(guān)系及在再障的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中的原理，為再障的防治提供可行思路，并為探究再障的免疫抑制治療方法提供可能的理論依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1研究對(duì)象
　　 收集鄭州大學(xué)第三、第一附屬醫(yī)院2009年10月至2010年6月兒科住院及門診的慢性再障患兒，將其分成兩組：初治期22例和恢復(fù)期22例，每組中男12例，女10例，年齡2-11歲；正

8、常對(duì)照組為我院外科近期無(wú)感染、無(wú)免疫相關(guān)性疾病患兒，共計(jì)15例，男8例，女7例，年齡1-11歲，其體檢各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。各組之間年齡差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)（見表3.1）。診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)均符合《小兒再障診療建議》[1]，所有恢復(fù)期患兒均不需輸血。
　　 2方法
　　 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+CD25in/highCD127lowTreg細(xì)胞的表達(dá)水平；提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，并提取該細(xì)胞中的總蛋白，

9、用Western-blotting的方法檢測(cè)NFAT1、Foxp3蛋白的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)所得的X光片結(jié)果應(yīng)用掃描儀進(jìn)行掃描，應(yīng)用QuanityOne軟件分析圖片中目的條帶的平均灰度及背景灰度，前者減去后者作為統(tǒng)計(jì)分析的數(shù)值，各樣品的最后統(tǒng)計(jì)數(shù)值為其灰度值與相應(yīng)內(nèi)參灰度值之比。
　　 3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有原始數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)表示

10、，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較分析采用LSD-t法，各變量之間的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)檢驗(yàn)，以a=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1．CAA初治期患兒外周血中CD4+CD25+、CD4+CD25hig、CD4+CD25+CD127low、CD4+CD25highCD127low占CD4+T細(xì)胞的百分比均較對(duì)照組降低(P＜0.05);恢復(fù)期的表達(dá)則較初治期升

11、高(P＜0.05)，而與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2．CAA初治期患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中Foxp3、NFAT1蛋白的表達(dá)水平分別為0.86±0.06、0.77±0.08;較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)；恢復(fù)期的表達(dá)水平分別為1.20±0.26、1.11±0.12；較初治期明顯升高（P＜0.05）。
　　 3．相關(guān)性分析
　　 (1)CAA患兒CD4+CD25highCD127low調(diào)節(jié)性T

12、細(xì)胞與外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)Foxp3、NFAT1蛋白的表達(dá)均呈正相關(guān)（r分別為0.857，0.880，P＜0.05）。
　　 (2)CAA患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)Foxp3與NFAT1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.807，P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．CAA患兒外周血CD4+CD25int/highCD127lowTreg細(xì)胞和NFAT1、Foxp3蛋白表達(dá)均降低，有可能在慢性再障的發(fā)病過程中起重要作用，且