重組人Dickkopf1蛋白的克隆、表達、純化及生物學活性的初步測定.pdf

1、黑素是皮膚成為褐色的主要色素。黑素是酪氨酸在酪氨酸酶作用下產生的，在黑素細胞的黑素小體中生成，黑素小體從一個黑素細胞被轉運至一群角質形成細胞。真、表皮內黑素細胞增生及黑素生成功能活躍是色素增多性疾病的一個主要原因。色素增多性疾病在皮膚科疾病中非常常見，最常見的是雀斑、黃褐斑及炎癥后色素沉著，發(fā)生在面部、手背等暴露部位顯著者嚴重影響患者的容貌，影響患者的生活質量。根據(jù)色素增多性疾病的發(fā)病機制，防治措施主要從抑制黑素細胞增殖及活性、防止黑素

2、生成及加速黑素降解等方面入手。目前針對色素增多性疾病防治的各種方法的療效、復發(fā)問題以及可能出現(xiàn)的不良反應，一直是皮膚科臨床醫(yī)師所面臨的棘手問題。 人掌跖部位皮膚的黑素含量比非掌跖部位低。近來研究發(fā)現(xiàn)，掌跖部位皮膚黑素細胞的密度是非掌跖部位皮膚的1/5，黑素小體、黑素相關蛋白含量也相應的顯著降低，其原因為掌跖部位皮膚中的成纖維細胞分泌的Dickkopf1蛋白能夠通過抑制黑素細胞Wnt信號轉導通路的活化進而抑制黑素細胞的增殖、發(fā)育、

3、分化及黑素生成能力。 本課題通過反轉錄PCR自人掌跖部位皮膚成纖維細胞中獲得了編碼Dickkop1的32-266位氨基酸的基因，克隆入PQE30質粒，構建了PQE30-dkk1原核表達質粒，經(jīng)雙酶切鑒定及序列分析證實所獲序列完全正確。然后將重組質粒轉化大腸桿菌M15得到高效表達，表達目的蛋白量約占菌體總蛋白的30％，經(jīng)SDS-PAGE鑒定及Westernblot鑒定證明表達蛋白為Dkk1蛋白。利用鎳瓊脂糖親和層析成功純化了Dkk

4、1蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定證明Dkk1蛋白的純度在90％以上。將純化的蛋白在含還原型—氧化型谷胱甘肽體系的復性液中復性，部分蛋白復性至純水中，經(jīng)lowery法測定蛋白濃度為60μg/ml。將Dkk1蛋白作用于體外培養(yǎng)的人黑素細胞，采用MTT法測定細胞增殖情況、倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化、氫氧化鈉裂解法測定黑素生成能力、多巴氧化法測定酪氨酸酶含量。結果表明Dkk1蛋白可降低黑素細胞的增殖能力、黑素生成能力和酪氨酸酶活性，而且這些抑制