重組人Dickkopf1蛋白的克隆、表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的初步測定.pdf

1、黑素是皮膚成為褐色的主要色素。黑素是酪氨酸在酪氨酸酶作用下產(chǎn)生的，在黑素細(xì)胞的黑素小體中生成，黑素小體從一個(gè)黑素細(xì)胞被轉(zhuǎn)運(yùn)至一群角質(zhì)形成細(xì)胞。真、表皮內(nèi)黑素細(xì)胞增生及黑素生成功能活躍是色素增多性疾病的一個(gè)主要原因。色素增多性疾病在皮膚科疾病中非常常見，最常見的是雀斑、黃褐斑及炎癥后色素沉著，發(fā)生在面部、手背等暴露部位顯著者嚴(yán)重影響患者的容貌，影響患者的生活質(zhì)量。根據(jù)色素增多性疾病的發(fā)病機(jī)制，防治措施主要從抑制黑素細(xì)胞增殖及活性、防止黑素

2、生成及加速黑素降解等方面入手。目前針對色素增多性疾病防治的各種方法的療效、復(fù)發(fā)問題以及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，一直是皮膚科臨床醫(yī)師所面臨的棘手問題。 人掌跖部位皮膚的黑素含量比非掌跖部位低。近來研究發(fā)現(xiàn)，掌跖部位皮膚黑素細(xì)胞的密度是非掌跖部位皮膚的1/5，黑素小體、黑素相關(guān)蛋白含量也相應(yīng)的顯著降低，其原因?yàn)檎契挪课黄つw中的成纖維細(xì)胞分泌的Dickkopf1蛋白能夠通過抑制黑素細(xì)胞Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化進(jìn)而抑制黑素細(xì)胞的增殖、發(fā)育、

3、分化及黑素生成能力。 本課題通過反轉(zhuǎn)錄PCR自人掌跖部位皮膚成纖維細(xì)胞中獲得了編碼Dickkop1的32-266位氨基酸的基因，克隆入PQE30質(zhì)粒，構(gòu)建了PQE30-dkk1原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定及序列分析證實(shí)所獲序列完全正確。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15得到高效表達(dá)，表達(dá)目的蛋白量約占菌體總蛋白的30％，經(jīng)SDS-PAGE鑒定及Westernblot鑒定證明表達(dá)蛋白為Dkk1蛋白。利用鎳瓊脂糖親和層析成功純化了Dkk

4、1蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定證明Dkk1蛋白的純度在90％以上。將純化的蛋白在含還原型—氧化型谷胱甘肽體系的復(fù)性液中復(fù)性，部分蛋白復(fù)性至純水中，經(jīng)lowery法測定蛋白濃度為60μg/ml。將Dkk1蛋白作用于體外培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞，采用MTT法測定細(xì)胞增殖情況、倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、氫氧化鈉裂解法測定黑素生成能力、多巴氧化法測定酪氨酸酶含量。結(jié)果表明Dkk1蛋白可降低黑素細(xì)胞的增殖能力、黑素生成能力和酪氨酸酶活性，而且這些抑制