靶向性抗腫瘤融合蛋白R(shí)GD-hIL-24的表達(dá)、純化及體外活性研究.pdf

1、惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅人類生命健康的“殺手”，手術(shù)、放療和化療是治療腫瘤的傳統(tǒng)方法。放療、化療因同時(shí)殺傷腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，副作用大，因此尋找特異、高效的腫瘤治療方法一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)。腫瘤靶向治療是利用特異性的載體或?qū)蛳到y(tǒng)，將藥物或其他殺傷腫瘤細(xì)胞的活性物質(zhì)選擇性地運(yùn)送到腫瘤部位，而不影響正常細(xì)胞、組織或器官的功能，從而提高療效、減少毒副作用。 腫瘤靶向治療中治療靶點(diǎn)、靶向載體和效應(yīng)分子的選擇是關(guān)鍵。人白細(xì)胞介素-24基因(h

2、umanInterleukin24，hIL-24)是1995年在人類黑色素瘤細(xì)胞中，用差減雜交技術(shù)新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，起初命名為黑色素瘤分化相關(guān)基因7(melanomadifferentiation-associatedgene7，mda-7)。2002年，鑒于其基因定位、遺傳結(jié)構(gòu)和細(xì)胞因子樣特性而被正式命名為白細(xì)胞介素24，屬于IL-10家族。實(shí)驗(yàn)證明hIL-24能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)還具有抑制腫瘤血管形成和免疫刺激效

3、應(yīng)。hIL-24因其獨(dú)特的抗腫瘤特性，已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的基因治療，IntrogenTherapeuticas公司研制的基因治療制劑Ad.IL-24(商品名為INGN241)已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明Ad.IL-24安全可靠，病人耐受性好，抗腫瘤效果顯著。因此，hIL-24是一類很有應(yīng)用前景的抗腫瘤制劑。 整合素是一類膜受體家族，由α和β兩個(gè)亞單位組成。在部分腫瘤細(xì)胞或者腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中，常特異性地高表達(dá)某些整合素，如

4、αvβ3，而正常細(xì)胞不表達(dá)或表達(dá)量很低。整合素αvβ3在腫瘤新生血管形成、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，可以作為一類新的腫瘤治療靶點(diǎn)；RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和血液中的粘附蛋白是人體中最常見的含RGD序列的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，大部分整合素與其配體的結(jié)合過程，是通過識(shí)別配體中所含的RGD序列來(lái)完成的。目前，利用噬菌體表面展示技術(shù)，已經(jīng)篩選出與一類與整合素αvβ3特異

5、性結(jié)合的RGD肽，即ACDCRGDCFCG(RGD-4C)，這類RGD肽可以作為腫瘤靶向載體，特異性地引導(dǎo)抗腫瘤藥物到達(dá)腫瘤部位，殺滅腫瘤細(xì)胞。 本研究以整合素αvβ3為腫瘤靶點(diǎn)，RGD-4C肽為腫瘤靶向載體，hIL-24蛋白為抗腫瘤效應(yīng)分子，構(gòu)建靶向性抗腫瘤融合蛋白R(shí)GD-hIL-24，并檢測(cè)其生物學(xué)活性，為深入探討RGD-hIL-24的體內(nèi)靶向抑瘤活性及腫瘤治療應(yīng)用前景奠定基礎(chǔ)。同時(shí)豐富了hIL-24在腫瘤治療中的應(yīng)用形式，

6、為腫瘤靶向治療提供了新思路。 方法： 1.采用PCR方法構(gòu)建RGD-hIL-24融合基因，并分別連接至表達(dá)載體pGEX-4T-1、pET-22b(+)和pQE-30，通過酶切、測(cè)序鑒定陽(yáng)性重組載體。 2.重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。Tris-TricinePAGE電泳及免疫印跡確定目的蛋白的表達(dá)，超聲破菌鑒定目的蛋白的表達(dá)形式。通過降低誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)劑濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化。對(duì)目的蛋白在3個(gè)表達(dá)載

7、體的表達(dá)情況進(jìn)行比較，選擇最佳的重組表達(dá)載體。 3.通過重組工程菌的發(fā)酵和高壓勻漿破菌，獲得大量RGD-hIL-24包涵體。洗滌后利用目的蛋白攜帶的6×His純化標(biāo)簽，采用陰離子交換層析和鎳離子親合層析的組合純化方案，純化融合蛋白R(shí)GD-hIL-24。透析和稀釋復(fù)性制備正確折疊的融合蛋白。 4.采用MTT比色法，檢測(cè)RGD-hIL-24抑制人黑色素瘤細(xì)胞A357和乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長(zhǎng)的特性；通過熒光染色法，分析RGD

8、-hIL-24誘導(dǎo)A357和MCF-7細(xì)胞凋亡能力；同時(shí)，采用細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和間接免疫熒光技術(shù)，檢測(cè)其在體外與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合特性，鑒定RGD-hIL-24的體外腫瘤靶向特性。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建RGD-hIL-24融合基因，分別連接至表達(dá)載體，構(gòu)建了3個(gè)重組表達(dá)載體RGD-hIL-24/pGEX-4T-1、RGD-hIL-24/pET-22b(+)和RGD-hIL-24/pQE30，DNA測(cè)序結(jié)果顯示，重組表達(dá)載體序列與

9、理論序列完全吻合。 2.重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化宿主菌后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。RGD-hIL-24/pGEX-4T-1、RGD-hIL-24/pET-22b(+)分別表達(dá)目的蛋白GST-RGD-hIL-24和RGD-hIL-24，表達(dá)量分別為35.62％和30.47％，超聲破菌鑒定目的蛋白的表達(dá)形式主要為包涵體。而RGD-hIL-24/pQE30經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后未見目的蛋白。比較3個(gè)載體的表達(dá)情況，結(jié)合純化難易程度，最后選擇pET-22b

10、(+)為表達(dá)載體。 3.對(duì)重組工程菌RGD-hIL-24/pET-22b(+)/BL21發(fā)酵，高壓勻漿破菌后，獲得RGD-hIL-24包涵體，洗滌后純度達(dá)到50％。采用陰離子交換層析和鎳離子親合層析的組合純化方案純化后，得到純度為85％以上的RGD-hIL-24，復(fù)性后RGD-hIL-24的蛋白濃度為0.86mg/ml。 4.MTT比色實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RGD-hIL-24融合蛋白能夠抑制人黑色素瘤細(xì)胞A357和乳腺癌細(xì)胞MCF

11、-7的生長(zhǎng)，且對(duì)正常人肺成纖維細(xì)胞NHLF沒有影響。與hIL-24對(duì)照相比，RGD-hIL-24的抑瘤活性略有提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；熒光染色分析表明，RGD-hIL-24能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)和間接免疫熒光表明RGD-hIL-24能夠特異性地結(jié)合腫瘤細(xì)胞，結(jié)合部位主要在細(xì)胞膜。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建RGD-hIL-24融合基因，在大腸桿菌高效表達(dá)融合蛋白R(shí)GD-hIL-24，且建立RGD-hIL-24的