RTA系列融合蛋白的表達及其抗腫瘤功能研究.pdf

1、Viral protein22(VP22)是Ⅰ型單純皰疹病毒的殼皮蛋白，作為一種細胞轉導肽(Cell-Penetrating Peptides，CPPs)，能介導其融合蛋白進入細胞并具有細胞間穿梭功能。TAT是來自HIV的含11個氨基酸的短肽，也是一種轉導肽，被廣泛用于轉導肽段、寡核苷酸和蛋白進入細胞。促性腺激素釋放激素(gonadotrophin releasing hormone，GnRH)是下丘腦分泌的含有十個氨基酸的短肽類激素，

2、它可以作用于垂體前葉促進促性腺激素的分泌。文獻報道在乳腺多種腫瘤細胞表面都有GnRH受體分布，這為GnRH作為大分子藥物載體提供了科學依據(jù)。氧依賴性降解區(qū)域(oxygen-dependent degradation domain，ODD)可以控制缺氧誘導因子-1a(HIF-1a)存在與否，在常氧條件下會通過羥化特定位點的脯氨酸，進而使HIF-1a被蛋白酶降解。缺氧是實體腫瘤的特征性病理改變，含有ODD的融合蛋白可以穩(wěn)定存在。蓖麻毒素A鏈

3、(Ricin Toxin A Chain，RTA)是蓖麻毒素的效應鏈，它是一種RNA特異性的N-糖苷酶，可催化核糖體60s亞基中28S rRNA的一個高度保守的環(huán)狀結構脫去一個特殊的腺嘌呤(在大鼠中為A-4324位)，從而使蛋白合成功能受阻，導致細胞死亡。
　　 本課題目的是以RTA作為抑制腫瘤細胞增殖的活性分子，利用GnRH、TAT以及VP22的作用將融合蛋白轉運進入腫瘤細胞，并利用ODD的降解作用減輕RTA對正常細胞的毒性，

4、提高融合蛋白對實體瘤的靶向性作用。構建pET28a-RTA、pET28a-VP22-RTA、pET28a-GnRH-RTA、pET28a-TAT-RTA及pET28a-VP22-ODD-RTA原核表達載體，轉化大腸桿菌BL21，誘導RTA融合蛋白的可溶性表達，超聲裂解表達后菌體，利用融合蛋白上的組氨酸標簽進行親和層析純化目的蛋白，在分子、腫瘤細胞和動物整體水平研究融合蛋白的腫瘤抑制活性。
　　 實驗方法：應用無細胞系蛋白合成抑制

5、實驗測定融合蛋白對蛋白合成的抑制作用；SRB法測定融合蛋白對腫瘤細胞生長的抑制作用；細胞免疫熒光法、細胞免疫化學法測定融合蛋白是否可以進入腫瘤細胞以及融合蛋白在細胞中的定位；應用流式細胞術測定融合蛋白誘導腫瘤細胞凋亡。以人肺腺癌細胞系A549細胞建立Bal b/c裸鼠荷瘤模型，將建模成功的荷瘤鼠分為四組，即TC(腫瘤對照組)組，RTA組，GnRH-RTA組和TAT-RTA組，用腹腔給藥的方式(實驗組融合蛋白3 mg/kg/天，對照組生理

6、鹽水200μL/只/天)測定融合蛋白在體內抑制腫瘤生長的作用，同時對荷瘤小鼠的血漿生化指標進行測定初步判斷融合蛋白對動物的毒副作用。
　　 實驗結果：①構建了pET28a-RTA系列原核表達載體，并利用該系列載體表達出可溶性的融合蛋白。②利用融合蛋白N端的His-tag，采用親和層析的方法進行了RTA融合蛋白的純化。③經(jīng)細胞免疫熒光、細胞免疫化學分析表明融合蛋白GnRH-RTA，TAT-RTA可以進入A549細胞、MDA-MB-

7、231細胞和H1299細胞。④經(jīng)無細胞系蛋白合成抑制實驗測定表明，融合蛋白RTA、GnRH-RTA、TAT-RTA、VP22-RTA和VP22-ODD-RTA均具有明顯的蛋白合成抑制活性，抑制活性由高到低依次是：VP22-ODD-RTA、VP22-RTA、RTA、TAT-RTA、GnRH-RTA。⑤經(jīng)SRB法測定表明GnRH-RTA、TAT-RTA、VP22-RTA和VP22-ODD-RTA在常氧和缺氧條件下都能夠有效地抑制A549細胞

8、的增殖，并且抑制細胞生長的作用隨著蛋白濃度的增加而呈增強的趨勢；其中TAT-RTA較其他RTA融合蛋白的抑制作用更強，VP22-ODD-RTA在常氧和缺氧條件下對A549的生長抑制作用沒有明顯的差別。SRB法還測定了融合蛋白對HepG2細胞、Hela細胞、MDA-MB-231細胞以及H1299細胞的增殖抑制作用。對HepG2細胞和Hela細胞：融合蛋白在常氧條件下對細胞均有增殖抑制作用，且成劑量依賴性，在缺氧條件下也都有增殖抑制作用，但

9、無劑量依賴性；對H1299和MDA-MB-231細胞：融合蛋白在常氧和缺氧狀態(tài)下均有生長抑制作用，在蛋白濃度大于10-7M時抑制作用較明顯，其中TAT-RTA的作用比其他融合蛋白顯著。同樣，SRB實驗結果表明VP22-ODD-RTA對HepG2、Hela、MDA-MB-231以及H1299細胞的作用在常氧和缺氧條件下無明顯差別。⑥流式細胞術結果顯示，在常氧狀態(tài)下RTA系列融合蛋白可以隨時間延長增加A549細胞早期凋亡的百分率，其作用在4

10、8 h最強，與培養(yǎng)基對照相比，TAT-RTA在給藥48 h時可顯著誘導A549細胞發(fā)生早期凋亡。⑦測量、計算各組實驗動物瘤體體積發(fā)現(xiàn)，與對照組比較RTA、GnRH-RTA、TAT-RTA顯示了較好的抑制瘤體生長的趨勢，但是給藥期間各組的動物體重分析表明RTA和TAT-RTA對實驗動物的毒性較大，導致動物體重明顯下降。⑨動物血漿生化指標測定結果表明，融合蛋白對動物的肝、腎功能都有不同程度的影響，以RTA和TAT-RTA最為明顯。