家蠶Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)供體質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)抗腫瘤T2融合蛋白的研究.pdf

1、家蠶桿狀病毒基因表達(dá)系統(tǒng)是高效的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。借鑒國(guó)外AcMNPV Bac-to-Bac快速基因表達(dá)系統(tǒng)工作原理,我們?cè)鴺?gòu)建了可利用我國(guó)特色經(jīng)濟(jì)資源昆蟲(chóng)一家蠶的Bac-to-Bac快速基因表達(dá)系統(tǒng)。利用細(xì)菌轉(zhuǎn)座子的基因定位轉(zhuǎn)移作用,在大腸桿菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)基因的重組,快速獲得重組病毒。利用該系統(tǒng),僅需要5-7天就能得到重組病毒。該系統(tǒng)由供體質(zhì)粒、DH10BmBac細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞和家蠶培養(yǎng)細(xì)胞、家蠶幼蟲(chóng)組成,利用該系統(tǒng)能夠在家蠶體內(nèi)表達(dá)重組外

2、源蛋白。
　　 在家蠶Bac-to-Bac快速表達(dá)系統(tǒng)中,供體質(zhì)粒為重組病毒的構(gòu)建提供含有目的基因表達(dá)框(啟動(dòng)子+多克隆位點(diǎn))的轉(zhuǎn)座元件,因此其中的表達(dá)框決定了所攜外源蛋白的表達(dá)方式以及下游蛋白質(zhì)純化等的技術(shù)路線。然而目前常用的供體質(zhì)粒如pFastBacHT只能滿足一般的重組蛋白表達(dá),沒(méi)有信號(hào)肽序列,難于有效引導(dǎo)表達(dá)的外源蛋白分泌到胞外;另外,表達(dá)的蛋白由于N端含有較多的附加序列,從而有可能影響重組蛋白的表達(dá)效率和理化性質(zhì),并有

3、可能進(jìn)一步影響其生物學(xué)活性。
　　 針對(duì)上述問(wèn)題,為了滿足家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白的不同需要,我們將商品化質(zhì)粒pFastBacHT進(jìn)行了如下改造:①將蛋白質(zhì)分泌信號(hào)肽序列插入到pFastBacHT供體質(zhì)粒中,使表達(dá)的重組蛋白能夠有效分泌到細(xì)胞外。通過(guò)基因操作技術(shù),將該桿狀病毒信號(hào)肽序列g(shù)p67 signal sequence重組入pFastBacHT供體質(zhì)粒中,得到了攜帶信號(hào)肽序列的供體質(zhì)粒,我們將之命名為pBacGP67a

4、,b,c。采用該供體質(zhì)粒,表達(dá)的蛋白質(zhì)就能夠有效分泌到細(xì)胞外,從而有利于外源蛋白的分離純化;②切除供體質(zhì)粒pFastBacHT多克隆位點(diǎn)前冗長(zhǎng)的附加序列,減少對(duì)外源重組蛋白的影響。將pFastBacHT供體質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)前的TEV序列刪除,使重組蛋白的N端僅融合為方便重組蛋白純化而設(shè)計(jì)的6×His序列。改造后的質(zhì)粒命名為pFastShorta,b,c。
　　 利用上述構(gòu)建的供體質(zhì)粒并利用家蠶Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng),構(gòu)建了表

5、達(dá)新型抗癌基因工程抗體基因(T2融合蛋白)的重組病毒。分別在家蠶細(xì)胞和家蠶幼蟲(chóng)內(nèi)進(jìn)行了表達(dá),分析了重組蛋白的表達(dá)規(guī)律,并利用親和層析技術(shù)純化了該重組蛋白。生物活性檢測(cè)結(jié)果表明,家蠶幼蟲(chóng)中表達(dá)的T2蛋白具有較好的生物學(xué)活性,說(shuō)明利用家蠶能夠成功表達(dá)抗腫瘤蛋白。
　　 本研究的意義在于:①通過(guò)對(duì)商品化供體質(zhì)粒pFastBacHT的改造,開(kāi)發(fā)了兩種不同用途的供體質(zhì)粒,便于重組蛋白的分泌、表達(dá)和純化,以滿足不同目的的需要。②利用家蠶Ba