雙重靶向性抗乳腺癌融合蛋白Δ1-9-G129R-T3原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及蛋白的誘導(dǎo)表達(dá).pdf

1、目的：
　　利用基因重組技術(shù),將具有特異性抑制乳腺癌細(xì)胞增殖作用的人催乳素受體(human prolactin receptor,hPRLR)拮抗劑Δ1-9-G129R-hPRL與具有特異性抗腫瘤血管生成活性的腫瘤抑素(tumstatin)的活性部位T3肽(69-88aa)進(jìn)行橋連,構(gòu)建新型雙重靶向性抗乳腺癌融合蛋白Δ1-9-G129R-T3的原核表達(dá)質(zhì)粒,并在原核表達(dá)宿主中進(jìn)行目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定,為進(jìn)一步進(jìn)行融合蛋白的功能

2、檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　首先以質(zhì)粒pET22b(+)G129R-G129R為模板,PCR擴(kuò)增兩端帶有限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和XhoI以及NdeI和BamHI識(shí)別序列的目的基因Δ1-9-G129R-hPRL,并利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行片段回收。再根據(jù)T3的cDNA序列,設(shè)計(jì)合成三段首尾互補(bǔ)的引物,采用重疊延伸PCR技術(shù),擴(kuò)增得到帶有限制性?xún)?nèi)切酶NdeI和XhoI以及BamHI和XhoI識(shí)別序列的目的DNA片段T3,并利用聚

3、丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行回收。然后,根據(jù)Δ1-9-G129R-hPRL的3’端與T3的5’端BamHI識(shí)別序列可互補(bǔ)的特點(diǎn),將回收得到的Δ1-9-G129R-hPRL和T3混合作為模板,利用Δ1-9-G129R-hPRL的上游引物和T3的下游引物,PCR擴(kuò)增得到帶有限制性?xún)?nèi)切酶 NdeI和XhoI酶切位點(diǎn)的融合基因片段Δ1-9-G129R-T3。將純化回收的Δ1-9-G129R-T3、Δ1-9-G129R-hPRL及T3片段通過(guò)T-A克隆分

4、別與pMD18-T載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后,經(jīng)藍(lán)白斑篩選,挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增,提取質(zhì)粒,NdeI和XhoI雙酶切鑒定后再次回收目的DNA片段。然后分別將雙酶切回收的目的基因片段插入pET22b(+)的NdeI和XhoI多克隆位點(diǎn),構(gòu)建原核表達(dá)載體pET22b-Δ1-9-G129R-T3、pET22b-Δ1-9-G129R和pET22b-T3。經(jīng)DNA序列測(cè)定正確后,將這三種重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)菌BL21(DE3),IP

5、TG誘導(dǎo)表達(dá)后收集菌體,超聲破碎,高速離心后分離沉淀和上清。最后通過(guò)SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)和鑒定融合蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示我們利用PCR擴(kuò)增的方法獲得了目的基因片段Δ1-9-G129R-T3(650 bp)、Δ1-9-G129R(586bp)和T3(72bp)。將NdeI和XhoI雙酶切回收的目的基因分別插入經(jīng)同樣雙酶切的pET22b(+),構(gòu)建3種重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b

6、-Δ1-9-G129R-T3、pET22b-Δ1-9-G129R和pET22b-T3。NdeI和XhoI雙酶切鑒定顯示酶切片段與插入的基因片段大小相符。DNA測(cè)序結(jié)果顯示,除2個(gè)同義突變外的DNA序列與GenBank中記載的cDNA序列完全一致。將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)后,利用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá),SDS-PAGE結(jié)果證實(shí),在超聲處理后的沉淀中出現(xiàn)新蛋白條帶,且與預(yù)期的分子量(約24.7 kD、22.2 kD、2.4 kD