基因1b型HCV不同準(zhǔn)種核心蛋白原核及真核質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、背景和目的:
　　 丙型肝炎病毒（HCV ）是引起我國(guó)慢性肝病的主要病因，核心蛋白（CORE ）在HCV 致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而CORE 主要通過(guò)與宿主細(xì)胞蛋白相互作用發(fā)揮其致病作用。我國(guó)主要流行基因1b 型HCV ，且同一基因型不同準(zhǔn)種致病性存在差異。利用分子克隆的方法構(gòu)建基因1b 型不同準(zhǔn)種CORE 原核和真核質(zhì)粒，鑒定、誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得不同準(zhǔn)種CORE ，進(jìn)一步獲得與CORE 相互作用的細(xì)胞蛋白質(zhì)組。
　　

2、方法:
　　 1. 用PCR 方法擴(kuò)增獲得基因1b 型不同準(zhǔn)種CORE 基因片段；
　　 2. 構(gòu)建不同準(zhǔn)種CORE 真核質(zhì)粒：pcDNA3.1 （+），并轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞，Westernblot 驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)CORE 的表達(dá)；
　　 3. 構(gòu)建7 種不同準(zhǔn)種CORE 原核質(zhì)粒，鑒定、誘導(dǎo)表達(dá)并篩選出高水平表達(dá)CORE 的原核質(zhì)粒；
　　 4. 誘導(dǎo)原核質(zhì)粒pTrc-CKS-CORE ，并利用色譜柱純化

3、獲得不同準(zhǔn)種CORE融合蛋白；
　　 5. 將純化好的CORE 與HepG2 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行His pull-down 試驗(yàn)，獲得與CORE 相互作用的細(xì)胞蛋白質(zhì)組。
　　 結(jié)果:
　　 1. 不同準(zhǔn)種CORE 真核質(zhì)粒構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染HepG2 細(xì)胞獲得了表達(dá)；
　　 2. 不同準(zhǔn)種CORE 原核質(zhì)粒構(gòu)建成功，不同原核載體表達(dá)CORE 不同，以載體pTrc-CKS 表達(dá)量最高，載體pMBp-C 次之，其余

4、原核載體未有明顯表達(dá)。
　　 3. 純化獲得了CKS-CORE-His 融合蛋白。
　　 4. 通過(guò)His pull-down 試驗(yàn)，得到了與融合蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白質(zhì)組。
　　 結(jié)論:
　　 1. 成功構(gòu)建CORE 真核表達(dá)質(zhì)粒并獲得表達(dá)，為進(jìn)一步細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證與CORE相互作用的蛋白質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)；
　　 2. 成功構(gòu)建HCV 不同準(zhǔn)種CORE 原核質(zhì)粒pTrc-CKS ，可以高效表達(dá)CORE